| 研究課題/領域番号 |
08457490
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
滝川 正春 岡山大学, 歯学部, 教授 (20112063)
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| 研究分担者 |
服部 高子 岡山大学, 歯学部, 助手 (00228488)
高橋 浩二郎 岡山大学, 歯学部, 助教授 (00144775)
中西 徹 岡山大学, 歯学部, 助手 (30243463)
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| キーワード | 軟骨細胞 / 血管内皮細胞 / HCS-2 / 8細胞 / 内軟骨性骨化 / 遺伝子クローニング / 遺伝子発現 / 結合組織増殖因子(CTGF) / アンチセンスオリゴマー |
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| 研究概要 |
1)ウサギ成長軟骨初代培養細胞をin vitroで増殖、分化させhcs-24遺伝子の発現を調べたところ肥大化期に最大となることが判明した。しかし、静止軟骨細胞や関節軟骨細胞では発現していなかった。又、TGF-βとhBMP-2はhcs-24遺伝子の発現を促進した。一方、bFGFやIGF-I、IGF-II、TNF-αは全く影響しなかった。
2)hcs-24のcDNAの全長を単離し、構造を決定したところ、コード領域は結合組織増殖因子(CTGF)と完全に一致した。
3)HCS-2/8細胞にhcs-24のアンチセンスオリゴマーを導入したところ、その増殖が著明に抑制され、プロテオグリカン合成は軽度に亢進した。また、ウサギ肋軟骨培養細胞に導入したところアルカリホスファターゼ活性が軽度に上昇した。
4)アンチセンスオリゴマーにより得られた結果がhcs-24遺伝子産物によるものであることを下記の抗体を用いてウエスタンブロットで確認した。
5)hcs-24の塩基配列よりペプチド断片を合成し、ウサギに免疫して特異抗体を得た。
6)上記抗体を用いてアフィニティクロマトグラフィーにてHCS-2/8細胞よりhcs-24遺伝子産物すなわちCTGFを純度90%以上にまで精製できた。又、精製物を添加することによりHCS-2/8細胞の増殖が促進された。
7)Hcs-24/CTGFが骨軟骨移行部の骨内の血管内皮細胞にも存在することを免疫染色法にて明らかにした。
8)血管内皮培養細胞にhcs-24のアンチセンスオリゴマーを導入したところ増殖が著明に抑制された。
9)hcs-24遺伝子産物を組み換えDNA技術を用いて大量に生産すべく、大腸菌で組み換え蛋白の生産を試みたが問題が多く、昆虫細胞-バキュロウイルス系に切り替えることとした。
10)上記抗体はHCS-2/8細胞のDNA合成を阻害した。
以上の結果、Hcs-24/CTGFは肥大軟骨細胞から産生され増殖軟骨細胞の増殖を促進し、一方、骨軟骨移行部で骨側から軟骨への血管侵入に関与する分子であることが示唆された。
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