遺伝子工学およびX線解析による甘味関連蛋白質の活性中心と立体構造の解明

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08458174
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 横浜国立大学
• 研究代表者: 栗原 良枝 横浜国立大学, 教育学部, 教授 (90017715)
• 研究分担者: 原田 繁春 東京大学, 薬学部, 助教授 (80156504) ; 大谷 裕之 横浜国立大学, 教育学部, 助手 (30213763)
• キーワード: ミラクリンcDNA / クルクリンcDNA / マビンリンcDNA / 大腸菌における発現

研究概要

1.ミラクリン、クルクリン、マビンリンの大腸菌における発現
ミラクリンおよびクルクリンcDNAをpET-32aのもつチオレドキシン遺伝子の下流に組み込み、大腸菌においてそれぞれ融合タンパク質の発現を試みた。その結果、両者とも菌体破砕液の可溶性画分に、それぞれの抗血清と交差反応を示すタンパク質の発現を確認した。また、今回発現した融合タンパク質は分子間ジスルフィド結合により二量体を形成していた。また、マビンリンIIcDNAをpET-15bのもつヒスチジンタグ遺伝子の下流に組み込み、大腸菌において融合タンパク質の発現を試みた。その結果、菌体破砕液の可溶性画分に抗マビンリンII血清と交差反応を示すタンパク質の発現を確認した。発現したタンパク質を精製し、甘味活性を測定したところ、活性を認めた。
2.ミラクリンおよびクルクリン単量体の作製
ミラクリンおよびクルクリンcDNAを改変し、二量体形成部位のシステインをセリンに変異させた単量体遺伝子を作製した。つぎに、クルクリン単量体遺伝子を用いて大腸菌における発現を試みた。その結果、発現したタンパク質は封入体を形成した。これを可溶化したのち、甘味および甘味誘導活性を測定したところ、活性は認められなかった。
3.マビンリン同族体の熱安定性と構造の比較
熱に安定な同族体II、III、IVおよび熱に不安定な同族体I-1の加熱による立体構造の変化をCDスペクトル法により測定した。加熱前のスペクトルは、いずれも典型的なα-ヘリックス構造を示した。熱に安定なII、III、IVは80℃で1時間加熱しても、それらのスペクトルは全く変化しなかった。一方、熱に不安定なI-1は80℃で1時間加熱すると、そのスペクトルは大きく変化し、加熱によりI-1のα-ヘリックス構造が崩れることを示唆した。したがって、マビンリン同族体の熱安定性の差異は、これらのα-ヘリックス構造の安定性の差に原因することが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Ogawa,H.et al.: "Structures and contribution to the antigenicity of oligosaccharides of Japanese cedar" Glycoconjugate Journal. 13. 555-566 (1996)
• [文献書誌] Hiura,A.et al.: "Taste-Modifying triterpene glycosides from Staurogyne merguensis" Phytochemistry. 43. 1023-1027 (1996)
• [文献書誌] Nirasawa,S.,Masuda,Y.,Nakaya,K.and Kurihara Y.: "Cloning and sequencing of a cDNA encoding a heat-stable sweet protein,mabinlin II" Gene. 181. 225-227 (1996)
• [文献書誌] 韮沢悟,栗原良枝: "味覚と高分子-甘味タンパク質および甘味誘導タンパク質の構造と機能-" 高分子. 45. 380-384 (1996)
• [文献書誌] 韮沢悟、増田豊、中谷一泰、栗原良枝: "甘味誘導タンパク質ミラクリンの酵母における発現" 日本味と匂学会誌. 2. 407-409 (1995)
• [文献書誌] 栗原良枝、山崎和男: "水を甘くする作用をもつ新しい甘味配糖体ストロジン(甘味阻害配糖体と甘味配糖体との構造の比較)" 化学と生物. 33. 633-634 (1995)
• [文献書誌] 渡辺正,桐村光太郎 編 栗原良枝ら共著: "味の秘密をさぐる" 丸善(日本化学会監修), 45 (1996)