| 研究課題/領域番号 |
08458174
|
|---|
| 研究機関 | 横浜国立大学 |
|---|
研究代表者 |
栗原 良枝 横浜国立大学, 教育人間科学部, 教授 (90017715)
|
|---|
| 研究分担者 |
原田 繁春 東京大学, 薬学部, 助教授 (80156504)
大谷 裕之 横浜国立大学, 教育人間科学部, 講師 (30213763)
|
|---|
| キーワード | ミラクリンcDNA / 酵母における発現 / クルクリン二量体 / 大腸菌における発現 |
|---|
| 研究概要 |
1)ミラクリンの大腸菌、酵母における発現
(1)大腸菌におけるミラクリン発現用プラスミドpET-32aMIR56を構築し、これを用いて大腸菌AD494(DE3)株を形質転換し、可溶性タンパク質としてチオレドキシン-ミラクリン融合タンパク質を得ることに成功した。発現したチオレドキシン-ミラクリン融合タンパク質を単離、精製し、チオレドキシン部分の切断を試みたがうまくいかなかったので、チオレドキシン-ミラクリン融合タンパク質の形で甘味誘導活性を測定したが、活性は認められなかった。
(2)分泌発現系を用いてミラクリンの大腸菌における発現を行った。ミラクリン発現用プラスミドpET-26bMIR89を構築した。これを用いて、大腸菌BL21(DE3)株を形質転換し、発現実験を行なったところ、可溶性タンパク質として組換えミラクリンを得ることに成功した。これを単離、精製し、甘味誘導活性を測定したが、活性は認められなかった。
(3)酵母におけるミラクリン発現用プラスミドpYES2MIR56を構築した。これを用いて、酵母INVSC2株を形質転換し、発現実験を行なった結果、可溶性タンパク質として組換えミラクリンを得ることに成功した。発現した組換えミラクリンを単離、精製した。この系において初めて糖鎖のある組換えミラクリンを得ることに成功した。組換えミラクリンの糖鎖含有量を測定した結果、糖鎖の含有量は天然ミラクリンより、わずかに少なかった。この組換えミラクリンの甘味誘導活性を測定したが、活性は認められなかった。
2)クルクリンの微不均一性に関する実験
従来のクルクリン精製法を改良した。また、これまで分離できなかったクルクリン同族体を単離し、活性のあることを確認した。
|
