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ミトコンドリアに輸送された前駆体蛋白質の延長ペプチドを切断除去(プロセシング)し、成熟体にするプロセシングペピチダーゼの前駆体認識の機構と構成サブユニットの役割を解明することを目標としている。
本年度は、次の2点について解析した。(1)本酵素により基質として特異的に認識され、特定の位置が切断されるために必要十分な前駆体延長ペプチドの基本構造を前駆体そのものと合成ペプチドとを用いて解析した。(2)本酵素の2つのサブユニット各々の役割と、基質結合や活性発現に関与しているアミノ酸を検索した。
1.リンゴ酸脱水素酵素およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの延長ペプチドを例に、系統的にアミノ酸を変換したペプチドを化学合成し、これらを用いてペプチダーゼとの親和性や切断(水解)反応速度を定量的に解析し、基質として要求される構造として、切断位置よりC末端側も関与していることが分かった。
2.これまで合成ペプチドを用いた解析により、切断点より近位のアルギニンおよび遠位の塩基性アミノ酸、および1位の疎水性アミノ酸の重要性が示唆されていたが、前駆体全体を用いても同様の要求性があることを確認した。
3.2つのサブユニットのcDNAの特定部位あるいはランダムに変異を与え、アドレノドキシン前駆体との共発現系を用いて変異酵素のスクリーニングを行った。変異酵素の基質認識と切断反応を解析し、酵素の活性中心金属の結合アミノ酸、基質結合に関与すると思われる酸性アミノ酸群、等の同定を行った。
4.酵母の2つのサブユニットのクローニングを行った。酵母とほ乳動物のサブユニットを大腸菌で発現させ、両者の安定なハイブリド酵素を作ることにより、これまで不安定で精製が困難であった酵素の精製を可能にした。
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