| 研究概要 |
ColE2群プラスミドのDNA複製系では,正,負の調節因子(複製開始Rep蛋白質とアンチセンスRNA)のおよその作用機構は明らかになっているが,これらの作用により複製開始の頻度が一定に保たれる仕組の詳細は不明である。
本年度の成果:1)Ori部位の内部機能構造(特異的結合配列,特異的結合促進配列,primer RNAの鋳型配列,必須複製開始配列)の確証のため,Ori部位の全域にわたり野生型とは異なる3種の塩基置換を導入し,得られた変異Ori部位について,in vivoのRep蛋白質結合能,DNA複製能を調べた.その結果,変異の位置によってRep蛋白質結合能とDNA複製能に及ぼす影響の程度に大きな違いがある3つの領域が存在することが明らかとなった.これらの内,左端領域中の変異では,結合に対してその活性が検出できないような大きな影響がある場合でも,複製活性はあまり大きな影響を受けないか,全く影響を受けない.複製に必要な弱い結合があるに違いないが,これはより感度の良いin vitroの方法で確認する必要がある.この領域でのRep蛋白質の結合が複製に必要な結合を補強している可能性が考えられる.2)この領域でのRep蛋白質の結合が過剰複製を抑えることにより,複製の負の調節に関与している可能性を検証するため,領域中の変異がプラスミドのコピー数に及ぼす影響を調べている.3)ColE8においてrep-RNAI領域の遺伝子量を変化させた時のRep蛋白質発現量が遺伝子量に比例しており,RNAIによる調節の機能がcisの構造でも低下していること,Rep蛋白質mRNAとRNAIとの結合は正常に起こることが明らかとなった.このプラスミドでRNAIによる調節に欠陥のある段階をかなり絞り込むことができた.
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