| 研究概要 |
1. MCMタンパク質と相互作用するクロマチン結合タンパク質の探索:
XMcm3と相互作用するタンパク質を抗XMcm3抗体による卵抽出液の免疫沈殿により調べた結果、Mcm2,4,5,6,7のツメガエルホモログが物理的な相互作用をしており、XMcm3-5、XMcm4-6-7が安定な複合体を形成していることを見いだした。次にファーウエスタン法によりXMcm3と相互作用するクロマチン結合タンパク質を検索したところ、ヒストンH3が相互作用することを見いだした。さらに、MCMと相互作用することが遺伝学的な研究から明らかにされている出芽酵母Cdc45のアフリカツメガエルホモログに対する抗体を用いてアフリカツメガエル卵抽出液のタンパク質を免疫沈殿したところMCMではなくDNAポリメラーゼαと共沈降する事を見いだした。
2. DNA複製開始に関わるクロマチン結合タンパク質の精製とその機能の検索:
卵抽出液から抗体を用いて精製した6種類のメンバーからなるMCM複合体は複製開始に必要であり、XMcm3-5あるいはXMcm2-4-6-7複合体には活性がないことを明らかにした。
3. DNA複製開始に関わるクロマチン構造の検出:
卵抽出液に精子核より調整した染色体DNAを加えて、核形成前とDNA複製開始反応が起こる核形成後のクロマチン結合タンパク質の変化を種々の抗体を用いて調べた。その結果、6種類のXMCMタンパク質はすべて核形成前にクロマチンに結合し、複製反応の進行に伴ってクロマチンから遊離することを見いだした。また、あらかじめクロマチンに結合させたXMcm3タンパク質はM期卵抽出液中に加えてクロマチンを凝縮させても結合していることを見いだした。また複製開始に必要なXCdc45については、クロマチンへの結合が核形成後に初めて起こること、またこの結合がDNAポリメラーゼαのクロマチンへの結合に必要であることがわかった。
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