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p27^<Kip1>と特異的に作用する蛋白質遺伝子を単離するために、p27に固有の機能を担うC末側領域を用いて、ツ-ハイブリッド法にてマウスT細胞のcDNAライブラリーをスクリーニングし、得られたクローンを塩基配列の決定により3種類の分子(クローン1、2、3)に分類した。酵母内では、3つのクローンともp27の全長およびC末側領域と特異的な結合能を示したほか、クローン2はサイクリンDとも会合した。in vitroの結合アッセイから、クローン1とp27が直接結合すること、さらに、欠失変異体を用いて、クローン1とp27の結合ドメインは両者ともにC末側にあることが判明した。増殖中の細胞内でのクローン1/p27複合体は現在のところ未同定であるが、in vitroの結合アッセイ系に細胞抽出液を加えると量依存的に両者の結合は阻害された。分画・加熱処理した細胞抽出液を用いることにより、この阻害分子は分子量10kd以上の蛋白質であると推定した。p27は増殖中の細胞内では、サイクリンD/Cdk4と複合体を形成していることから、組み換え蛋白質を用いたところ、サイクリンD/Cdk4複合体が特典的にクローン1とp27の結合を阻害した。クローン2は、in vitroの結合アッセイにおいてp27のみならずサイクリンD、Cdk4とも結合能を示したが、p21、サイクリンB、Cdk2とは結合しなかった。組み換えサイクリンD/Cdk4複合体を用いたin vitroキナーゼアッセイにおいて、クローン2はp27のCdkインヒビター活性に影響を及ぼさなかったが、サイクリンD/Cdk4複合体の蛋白質キナーゼ活性を量依存的にかつ特異的に上昇させた。今後、クローン3の全長cDNAの単離も含め、これら3つのp27結合蛋白質について細胞内における生理的機能の解析を進める。
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