トランスジーン組込み部位に特徴的なDNA構造の解析と高頻度組換えベクターの開発

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08458239
• 研究機関: 広島大学
• 研究代表者: 森川 弘道 広島大学, 理学部, 教授 (00089129)
• 研究分担者: 五島 直樹 広島大学, 理学部, 助教授 (70215482)
• キーワード: トランスジーン / 組込み(integration) / S / MAR配列 / 位置効果 / パーティクルガン法 / site-directed / トポイソメラーゼ / タバコ培養細胞

研究概要

本研究はパーティクルガン法により得られた、トランスジェニック培養細胞や同植物のゲノムDNAにおける外来遺伝子組込部位近傍のDNA塩基配列を決定し、その構造的特徴を解析すると共に、組込部位近傍のゲノムDNA断片を利用した高頻度組み換えベクターを開発することを目的とする。
本年度は、以下の成果を挙げた。
1)タバコ培養細胞のジャンクション領域の中で507bpのゲノム塩基配列をTJ1と命名し、このDNA配列の諸性質について調べた。TJ1は、ポリアクリルアミド電気泳動法(4℃と70℃)より湾曲構造をとっていることが予想され、タバコ培養細胞核骨格との結合実験の結果、TJ1は核骨格と特異的に結合し、SARであることが確認された。
2)このTJ1をpCaMVNEOプラスミドのCaMV 35S pro-nptII-noster発現カセットの両端に挿入したpTJ1NEOプラスミドを構築し、このプラスミドを外来遺伝子としてBY-2にパーティクルガン法によって遺伝子導入したところ、pCaMVNEOと比較して形質転換効率で約10倍の上昇が、nptII遺伝子1コピーあたりの遺伝子発現量は約5倍の上昇が認められた。
3)pARK22を遺伝子導入したシロイヌナズナ形質転換体2株、pCHを導入遺伝子したシロイヌナズナ形質転換体1株について、合計9箇所の外来遺伝子組込みジャンクション領域(1.8〜5.4kbp)をクローニングし、塩基配列を決定した。その結果、9箇所のジャンクション領域の中で8箇所はAT含量が59%以上を示し、A-Box、T-Box、TopII-Boxなど核骨格結合領域(SAR)に検出されるコンセンサス配列が高頻度に検出された。また、核骨格との結合実験の結果、すべてのジャンクション領域において核骨格と特異的な結合性を示し、SARであることが確認された。

研究成果

• [文献書誌] M.Takahashi: "High frequency stable transformation of Arabidopsis thaliana by particle bombardment." Jounal of Plant Research. 109・3. 331-334 (1996)
• [文献書誌] H.Anzai: "Transformation of Phalaenopsis by particle bombardment" Plant Cell Molecular Biology. 13・3. 265-272 (1996)
• [文献書誌] M.Takahashi: "Starvation treatment increases transient expression frequency of a foreign gene introduced into Eustoma gradiflorum root tissues by particle bombardment" Plant Cell Molecular Biology. 13・3. 311-315 (1996)
• [文献書誌] H.Inada: "Existence of three regulatory regions each containing a highly conserved motif in the promoter of plastid-encoded RNA polymerase gene (rpo B)." Plant Journal. 11・4. 883-890 (1997)
• [文献書誌] M.Takahashi: "Stable transformation of Eustoma grandiflorum by particle bombardment" Plant Cell Reports(in press). (1998)
• [文献書誌] G.Arimura: "Expression of the β-glucuronidase gene introduced into intact leaves attached to Arabidopsis thaliana plants by particle gun" Plant Biotechnology(in press). (1998)
• [文献書誌] H.Morikawa: "In “Pollen biotechnology for crop production and improvement" eds.by R.K.Sawhney and K.V.Shivanna,Cambridge University Press,pp.423-437(1997)." Use of pollen in gene transfer., 448 (1997)
• [文献書誌] M.Seki: "In Methods in Molecular Biology,ed.,J.Martinez-Zapater and J.Salinas,Humana Press Inc.,pp.219-225(1998)." Transient expression of foreign genes in tissues of Arabidopsis thaliana by bombardment-mediated transformation, 300 (1998)