14-3-3ファミリーのシグナリング機構の解析

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08458254
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 研究機関: 東京都立大学
• 研究代表者: 磯辺 俊明 東京都立大学, 理学部, 助教授 (70106607)
• 研究分担者: 田岡 万悟 東京都立大学, 理学部, 助手 (60271160)
• キーワード: 情報伝達 / 細胞周期 / がん遺伝子 / 14-3-3タンパク質 / タンパク質相互作用 / 一次構造 / 結合部位 / モノアミン合成

研究概要

細胞の増殖・分化シグナル伝達系での14-3-3ファミリーの役割とその分子機構を解析する目的で、14-3-3タンパク質(η鎖)とその変異体を大腸菌で発現し、Ras-MAPキナーゼシグナル伝達系の2種類のがん関連遺伝子産物(Raf-1とBcrキナーゼ)に対する14-3-3の結合部位を解析した。グルタチオンS転移酵素(GST)との融合タンパク質として発現したη鎖またはその変異体と、バキュロウィルス-昆虫細胞で発現したRaf-1またはBcr(第1エキソンコード領域:1-412)の複合体形成の有無を解析したところ、全長のη鎖、およびη鎖の171-213の構造領域(box-1)を含む変異体のみがこれらのキナーゼと特異的に結合した。box-1領域は、Ca^<2+>/カルモデュリン依存性タンパク質キナーゼII(PKII)でリン酸化されたトリプトファン水酸化酵素(TPH)に対する特異的な結合部位であることが本研究の過程ですでに明らかにされている。さらに、GST-ηあるいはbox-1のみを欠損したGST-η(Δbox-1)をラット脳幹抽出液に加えたのち、カルモデュリン存在下でリン酸化処理して生じた複合体の分析から、14-3-3のbox-1領域は、TPH、Raf-1、Bcrをはじめとする多くの標的タンパク質に対する共通の結合部位となっていると結論した。この事実を確認し、さらに細胞内での14-3-3の役割を直接的に証明する目的で、box-1領域のみに結合する特異抗体を調製した。分離・精製したIgG抗体は、リン酸化TPHに対する14-3-3の作用を阻害することが実証された。

研究成果

• [文献書誌] Muratake,T.,Isobe,T.et al.: "Structural organization and chromosomal assignment of the human 14-3-3 η chain gene" Genomics. 36. 63-69 (1996)
• [文献書誌] Song,S.-Y.,Isobe,T.et al.: "Changes in the gene expression of a protein with the cdc 10/SWI6 motif,V-1,during rat follicular development" Endocrinology. 137. 1423-1428 (1996)
• [文献書誌] Nakayama,H.,Isobe,T.et al.: "Capillary column HPLC-ESI/TSQMS analysis of proteins separated by 2D-HPLC : Application to cerebellar protein mapping" J.Chronatogr.730. 279-287 (1996)
• [文献書誌] 田岡万悟・磯辺俊明: "小脳の形成と成熟に関与するタンパク質" 生体の科学. 47. 190-198 (1996)
• [文献書誌] 新開史子・磯辺俊明: "14-3-3蛋白質ファミリー:その構造とシグナル伝達系での役割" 蛋白質核酸酵素. 41. 313-326 (1996)
• [文献書誌] 磯辺俊明・市村徹: "14-3-3蛋白質ファミリーと細胞内情報伝達" 細胞工学. 16. 70-76 (1997)
• [文献書誌] 磯辺俊明: "分子細胞生物学辞典(分担執筆)" 東京化学同人, 1040 (1997)