| 研究概要 |
本研究は,サンプル液に二次抗体とキメラ発光酵素さらに発光基質を添加し混合するだけで短時間に抗原濃度が測定できるホモジニアス免疫測定法を開発することを最終目標とし,エネルギー移動を利用した発光波長変換によるホモジニアス免疫測定法の原理実証を行なった.すなわち,抗体に対する結合活性と発光活性を有するキメラ発光酵素で標識された二次抗体が,抗原-抗体反応により抗原を介して固相化抗体(一次抗体)のごく近傍に固定化される.その結果,キメラ発光酵素と固相化抗体も互いに接近する.この抗原-抗体反応による複合体生成に伴うキメラ酵素と固相化抗体の距離の変化を,数nm程度の距離の変化を感度良く反映する励起エネルギー移動現象を利用して検出しようと試みた.
まずより感度の高い免疫測定を可能にするため,より抗体結合能の高いプロテインGとウミホタル発光酵素のキメラを新規に作製し,プロテインAを用いたキメラよりも約2倍の抗原検出感度を得ることに成功した.興味深いことにプロテインGと発光酵素を直接結合させた場合には充分な抗体結合活性が得られず,間にプロテインAを介して結合させることにより高い抗体結合活性が得られた.
次に昨年度の研究より,発光酵素と蛍光標識抗体をより近接させた方が効率よくエネルギー移動が起こることが示唆されたため,発光酵素のN末端側に抗原エピトープを遺伝子工学的に結合させ,これと蛍光色素標識特異的抗体との結合でエネルギー移動が観察されるかどうかを検討した.現在発現ベクター遺伝子の作製まで行なった段階である.これが確認されれば,ここに抗原あるいは末標識抗体を加えてエネルギー移動量が変化するかどうかを検討する.
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