シャペロニンを用いたタンパク質のin vitro及びin vivoの安定化

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08555205
• 応募区分: 試験
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 今中 忠行 京都大学, 工学研究科, 教授 (30029219)
• 研究分担者: 愛水 重典 東洋紡(株), 敦賀バイオ研究所, 所長 ; 高木 昌宏 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (00183434)
• キーワード: 超好熱菌 / 進化 / ゲノム / Pyrococcus / RNAポリメラーゼ / 分子シャペロニン / 窒素代謝 / 真核生物

研究概要

【1】超好熱菌由来シャペロニンタンパク質の性格づけ
我々は既に、超好熱菌Pyrococcus sp.KOD1 由来シャペロニンタンパク質をコードする遺伝子を解析し、1641 base(547アミノ酸)の配列を明らかにした。さらに菌を宿主として、シャペロニンタンパク質を大量に取得し、精製する手法も確率した。精製されたシャペロニンを用いて、活性(ATPase活性を示す)、熱安定性、有機溶媒に対する安定性等について解析した。ATPase活性は95°Cで最高値を示した。
【2】酵素熱安定化効果
酵母アルコール脱水素酵素に対する、熱安定化効果について検討した。シャペロニンと酵素の共存状態における熱安定化に及ぼすATPの影響、要求性についても解析した。高濃度のシャペロニンが存在するとATP無添加でも酵素を安定化するという興味ある現象を発見した。
【3】細胞内同時発現によるフォールディング促進効果
細胞内における遺伝子産物のフォールデイングについて解析する。ここでは、高発現ベクターにより大腸菌を宿主として生産させたモノクローナル抗体遺伝子とシャペロニン遺伝子とを、それぞれ同じ強さのプロモーターの下流に連結し、同一プラスミドベクターにタンデムに連結し、双方を大腸菌内で高発現させて、細胞内における遺伝子組変え産物のフォールディングを適切に行い、インクルージョンボディー形成が抑制された。この現象は調べた外来タンパク質のすべてに適用可能であった。

研究成果

• [文献書誌] Fujiwara,S.et al: "The world of archaea : genomu analysis,evolution and thermostable enzymes" Gene. 179. 165-170 (1996)
• [文献書誌] Fujiwara,S.et al.: "Unusual enzyme characteristics of aspartyl-tRNA synthetase from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus sp.KOD1" FEBS Lett.394. 66-70 (1996)
• [文献書誌] Tachibana,Y.et al.: "Cloning and expression of the α-amylase gene from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus sp.KOD1 and characterization of the enzyme" J.Ferment.Bioeng.82・3. 224-232 (1996)
• [文献書誌] Yan,Z.et al.: "In vitro stablization and in vivo solubilization of foreign proteins by the β subunit of chaperonin from the hyperthermophilic archeon Pyrococcus sp.strain KOD1" Appl.Environ.Microbiol.63・2. 785-789 (1996)
• [文献書誌] Rahman R.N.A.et al.: "Gene cloning and sequence analysis of cobyric acid synthase and cobalamin (5-phosphate synthase from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus sp.KOD1" J.Ferment.Bioeng.83・1. 109-112 (1997)
• [文献書誌] Siddiqui M.A.et al.: "Gene cloning,sequencing and enzyme characterization of Indolepyruvate ferredoxin oxidoreductase from the hyperthemophic archaeon Pyrococcus sp.KOD1" Mol.Gen.Genet.(印刷中). (1997)
• [文献書誌] Jongsareejit,B.et al.: "Gene cloning,sequencing and enzyme proerties of glutamate synthase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus sp.KOD1" Mol.Gen.Genet.(印刷中). (1997)
• [文献書誌] 今中忠行ら: "超好熱菌シャペロニンのin vivo及びin vitroでの効果" 化学と生物. 34・11. 707-709 (1996)
• [文献書誌] 今中忠行ら: "特殊環境下の微生物とその応用" 化学工学. 60・11. 822-824 (1996)
• [文献書誌] 今中忠行ら: "超好熱菌と耐熱性酵素" 応用酵素協会誌. (印刷中). (1997)
• [文献書誌] 今中忠行ら: "超好熱菌の耐熱性酵素" 油化学会誌. (印刷中). (1997)