シャペロニンを用いたタンパク質のin vitrおよびin vivoの安定化

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08555205
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 今中 忠行 京都大学, 工学研究科, 教授 (30029219)
• 研究分担者: 愛水 重典 東洋紡(株), 敦賀バイオ研究所, 所長 ; 高木 昌宏 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助教授 (00183434)
• キーワード: 超好熱菌 / 進化 / ゲノム / Pyrococcus / RNAポリメラーゼ / 分子シャペロニン / 窒素代謝 / 真核生物

研究概要

【1】超好熱菌由来シャペロニンタンパク質の性格づけ
我々は既に、超好熱菌Pyrococcus sp.KOD1由来シャペロニンタンパク質をコードする遺伝子を解析し、1641base(547アミノ酸)の配列を明らかにした。さらに菌を宿主として、シャペロニンタンパク質を大量に取得し、精製する手法も確立した。精製されたシャペロニンを用いて、活性(ATPase活性を示す、熱安定性、有機溶媒に対する安定性等について解析した。ATPase活性は95°Cで最高値を示した。
【2】酵素熱安定化効果
酵母アルコール脱水素酵素に対する、熱安定化効果について検討した。シャペロニンと酵素の共存状態における熱安定化に及ぼすATPの影響、要求性についても解析した。高濃度のシャペロニンが存在するとATP無添加でも酵素を安定化するという興味ある現象を発見した。
【3】細胞内同時発現によるフォールディング促進効果
細胞内における遺伝子産物のフォールディングについて解析する。きこでは、高発現ベクターにより大腸菌を宿主として生産させたモロクローナル抗体遺伝子とシャペロニン遺伝子とを、それぞれ同じ強さのプロモーターの下流に連結し、同一プラスミドベクターにタンデムに連結し、双方を大腸菌内で高発現させて、細胞内における遺伝子組替え産物のフォールディングを適切に行い、インクルージョンボディー形成が制御された。この現象は調べた外来タンパク質の全てに適用可能であった。

研究成果

• [文献書誌] FUJIWARA,S.et al: "The World of archaea : genomu analusis,evolution and thermostable enzumes" GENE. 179. 165-170 (1996)
• [文献書誌] FUJIWARA,S.et al: "Unusual enzyme characteristics of aspartyl-tRNA synthetase from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus sp.KOD1" FEBS Lett.394. 66-70 (1996)
• [文献書誌] TACHIBANA,Y.et al: "Cloning and expressionof the d-amylase gene from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus sp.KOD1 and characterization of the enzyme" J.Ferment.Bioeng.82・3. 224-232 (1996)
• [文献書誌] YAN,Z。et al.: "In vitro stabilization and in vivo solubilization of foreign proteins by the β-subunit of a chaperonin from the hyperthermophilic archeon Pyrococcus sp.strain KOD1" Appl.Environ.Microbiol.63・2. 785-789 (1997)
• [文献書誌] RHAMAN R.N.A.et al.: "Gene cloning and sequence analysis of cobyric asid synthase and cobalamin (5-phosphate) synthase from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus sp.KOD1" J.Ferment.Bioeng.83・5. 109-112 (1997)
• [文献書誌] SIDDIQUI M.A.et al: "Indolepyruvate ferredoxin oxidoreductase from Pyrococcus sp.KOD1 prossesses a mosaic structure showing features of oxidoreductases" Mol.Gen.Genet.254. 433-439 (1997)
• [文献書誌] JONGSAREEJIT,B.et al.: "Gene cloning,sequencing and enzymatic properties of glutamate synthase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus sp.KOD1" Mol.Gen.Genet.254. 635-642 (1997)
• [文献書誌] 今中忠行ら: "超好熱菌シャペロニンのin vivo及びin vitroでの効果" 化学と生物. 34・11. 707-709 (1996)
• [文献書誌] 今中忠行ら: "特殊環境下の微生物とその応用" 化学工学. 60・11. 822-824 (1996)
• [文献書誌] 今中忠行ら: "超好熱菌と耐熱性酵素" 応用酵素協会誌. 31. 1-8 (1996)
• [文献書誌] 今中忠行ら: "超好熱菌と耐熱性酵素" 油化学会誌. 45・5. 43-51 (1997)