糸状菌の生産するラクトナーゼを用いるパントラクトン光学分割法の開発

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08556013
• 応募区分: 試験
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 清水 昌 京都大学, 農学部, 教授 (70093250)
• 研究分担者: 小川 順 京都大学, 農学部, 助手 (70281102) ; 片岡 道彦 京都大学, 農学部, 助手 (90252494) ; 小林 達彦 京都大学, 農学部, 講師 (70221976) ; 坂本 恵司 富士薬品工業(株), 研究所, 主任研究員
• キーワード: ラクトナーゼ / Fusarium oxysporum / パントラクトン / 酵素的光学分割 / 固定化酵素

研究概要

高度な立体選択性を有するFusarium oxysporumのラクトナーゼを用いた酵素的なパントラクトンの光学分割方式の開発を試みた。
1.F.oxysporumの培養条件検討によるラクトナーゼ高活性菌の調製 F.oxysporumの培養条件の変化による酵素の生産量の増大を検討した結果、炭素源としてはグリセロールが、窒素源としてはポリペプトンが酵素活性発現に有効であった。また、本菌からの酵素の調製法として界面活性剤などによる抽出法の開発を行ったが、特に効果の見られるものはなかった。
2.ラクトナーゼ遺伝子のクローニングと大量発現 ラクトナーゼ高活性菌を得る別法として、遺伝子組換え技術の導入を試みた。すでに得られている精製酵素からの内部ペプチドのアミノ酸1次構造の情報をもとにプローブを作成し、本菌からのラクトナーゼをコードするゲノムDNAおよびcDNAのクローニングを行った。現在、ラクトナーゼをコードする遺伝子を含む組換えプラスミドを大腸菌に形質転換紙、酵素の発現を試みている。
3.ラクトナーゼの固定化条件の検討 F.oxysporumの菌体を直接触媒として用い、菌体の再使用を試みたところ、数回の利用で活性は半分以下となった。そこで、F.oxysporumの菌体および抽出した酵素の固定化による酵素の安全性の増加を試みた。菌体についてはアルギン酸カルシウムやアクリルアミドゲル等を用いた固定化、酵素については各種吸着体への固定化の検討を行った。菌体についてはアルギン酸カルシウムによる固定化が効果的であった。また、酵素に関してはデュオライトA-568による固定化が効果的であった。現在、固定化菌体・固定化酵素を用いてパントラクトンの光学分割条件の検討を行っている。

研究成果

• [文献書誌] Himuzu,S.and M.Kataoka: "Optical resolution of pantolactone by a novel fungal enzyme,lactonohydrolase" Annals of the New York Academy of Sciences. 799. 650-658 (1996)
• [文献書誌] Kataoka,M.et al.: "Optical resolution of racemic pantoic acid through microbial stereoselective lactonization in an organic solvent/water two-phase system" Enzyme Microb.Technol.19(9). 307-310 (1996)
• [文献書誌] Shimizu,S.and M.Kataoka: "Structure,function,and application of microbial lactonases" CHIMIA. 50(9). 409-410 (1996)
• [文献書誌] Kataoka,et al.: "Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of aldehyde reductase from a red yeast,Sporobolomyces salmonicolor" Acta Cryst.D52. 405-406 (1996)
• [文献書誌] Kobayashi,M.et al.: "Hyperinduction of nitrile hydrtase acting on indole-e-acetonitrile in Agrobacterium tumefaciens" Appl.Microbiol.Biotechnol.45. 176-181 (1996)
• [文献書誌] Ogawa,J.et al.: "Novel metabolic transformation pathway for cyclic imides in Blastobacter sp.strain A17p-4" Appl.Environ.Microbiol.62(10). 3814-3817 (1996)