研究分担者 |
山崎 浩司 北海道大学, 水産学部, 助教授 (40250500)
猪上 徳雄 北海道大学, 水産学部, 教授 (60002086)
横本 敬紀 パーキンエルマーアプライドバイオシステムズ, 事業部, 研究員
木村 凡 東京水産大学, 水産学部, 助教授 (50262340)
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研究概要 |
新規ヒスタミン生成菌および缶詰変敗菌の迅速検出・同定システムの開発を目的として以下の研究を行った。 藤井・木村(東京水産大学)・横本(パーキンエルマジャパン) 本年度は、平成8,9年度研究で決定したP.histaminumおよびデータベース上に登録されているヒスタミン生成菌、M.morganii,E.aerogenes,K.planticolaのヒスチジン脱炭素酵素の遺伝子配列から、相同性が高くプライマーに適していると思われる位置を決定し、PCR法によりヒスタミン生成菌が検出できるかの条件検討を行った。目的の長さの増幅断片がhdcを有するグラム陰性菌にのみ見られ、増幅断片をクローニング後配列の一部を決定したところ、増幅産物はhdcの目的領域であることを確認できた。魚体等より分離されたヒスタミン生成能を持つグラム陰性株15株のうち、14株にバンドが検出された。ヒスタミン生成能を持たない株132株ではバンドは検出されなかった。また、横本らと共同で、蛍光プロープPCR法(TaqMan法)の食品からの細菌の迅速検出・同定応用への実効性について、サルモネラをモデルに培養法と比較することで証明した。 猪上・山崎(北海道大学) 本年度はまず平成8年度および9年度に確立したAlicyclobacillus acidoterrestrisおよびClostidium perfiringensの迅速検出法に最適な食品試料からの核酸調製法を検討し,A.acidoterrestrisでは15時間の前培養後にRNeasy Total RNAキットを使用した核酸抽出法,またCl.perfiringensでは前培養後にLysis-Phenol-Chloroform法が最も適当であることを見出した。最後に、今回開発した迅速検出法を実際の食品へ応用し,A.acidoterrestrisでは混入菌体量2cells/ml以上ならびCl.perfiringensでは1cell/ml以上で検出可能であることを確認し,その実用性の高さを証明した。
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