| 研究課題/領域番号 |
08556034
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
水産化学
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| 研究機関 | 東京水産大学 |
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研究代表者 |
藤井 建夫 東京水産大学, 水産学部, 教授 (30093305)
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| 研究分担者 |
信濃 晴雄 北海道大学, 水産学部, 教授(元) (10001603)
山崎 浩司 北海道大学, 水産学部, 助教授 (40250500)
猪上 徳雄 北海道大学, 水産学部, 教授 (60002086)
横本 敬紀 パーキンエルマ アプライドバイオシステムズ事業部, 研究員
木村 凡 東京水産大学, 水産学部, 助教授 (50262340)
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| 研究期間 (年度) |
1996 – 1998
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| キーワード | ヒスタミン / 迅速検出 / 遺伝子手法 / TaqMan法 / Alicyclobacillus acidoterrestris / Clostridium perfiringens / Alicyclobacillus acidoterrestris / Clostridium perfringens |
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| 研究概要 |
赤身魚によるアレルギー様食中毒の原因となるヒスタミン産生菌及び酸性飲料変敗原因菌の迅速検出法の開発を目的として以下の研究を行った。
1. 藤井、木村(東京水産大学)及び横本(パーキンエルマジャパン)
ヒスチジン脱炭酸酵素遺伝子を標的としたPCR遺伝子増幅法を開発するために、好塩性ヒスタミン生成菌(Photobacterium histaminum)のヒスチジン脱炭酸酵素を精製し、N末端アミノ酸配列→PCR法→サザンハイプリダイゼーション→プロープ上流・下流領域の遺伝子塩基配列決定の手順で仕事をすすめ、本菌のヒスチジン脱炭酸酵素の全構造遺伝子配列を明らかにした。さらに、決定したP. histaminumおよびデーターベース上に登録されているヒスタミン生成菌のヒスチジン脱炭酸酵素の遺伝子配列をもとに、PCRプライマーを設計し、PCR法によりヒスタミン生成菌が検出のための条件検討を行った。
また、PCR法を食品の現場へ応用するための簡便性を目的とし、横本(パーキンエルマジャパン)と共同で、PCR増幅遺伝子の検出を蛍光感知機のみで(電気泳動不要)検出できる方法(TaqMan法)を、代表的な食中毒菌であるサルモネラなどに応用し、食品からの細菌の迅速検出・同定応用への実効性について、培養法と比較することで証明した。
2. 信濃、猪上、山崎(北海道大学)
変敗飲料缶詰から新しいタイプの変敗原因菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)を分難・同定し、この細菌の迅速検出用プライマーを16SrDNA塩基配列内に設計し、RT-PCR法が非常に高い特異性と感度を有していることを確認した。また、RAPD法で他の類縁菌種と区別し得ることを見出した。さらに、Clostridium perfringensの蛍光プローブPCR法による迅速検出法についても検討し、本法の最適反応条件を決定した。また、本菌は、16S/23S intergenic spacer regionの長さを比較することで、他のClostridium属細菌と区別し得ることも確認した。確立したAlicyclobacillus acidoterrestrisおよびClostridium perfiringensの迅速検出法に最適な食品試料からの核酸調製法を検討しその実用性の高さを証明した。
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