エクリオン遺伝子導入による細胞内カルシウム動態の長期連続測定解析法の開発

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08557006
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 本間 さと 北海道大学, 医学部, 助教授 (20142713)
• 研究分担者: 白川 哲夫 北海道大学, 歯学部附属病院, 講師 (00187527) ; 近藤 孝男 名古屋大学, 理学部, 教授 (10124223)
• キーワード: 生物発送 / エクリオン / 細胞内カルシウム / 遺伝子導入

研究概要

CMVプロモータ下流にアポエクオリン遺伝子を組み込んだ、発現ヘクターをNIH3T3細胞に導入し、エクオリン遺伝子を高率に発現する株細胞を樹立した。この細胞を用いて、以下の実験を行い、カルシウム動態測定系として利用できることを示した。
1.カルシウム容量依存性エクオリン発光の検出と標準曲線の作成
カルシウムフリー下で基質セレンテラジンと反応させた後、10^<-9>〜1Mの濃度でカルシウムを滴下し、発光量とカルシウム量の関係を測定した。その結果、10^<-5>M以上のカルシウムに、容量依存性にフラッシュ状発光が確認された。カルシウム発光の標準曲線を作成し、発光量の検出で細胞内カルシウム量判定が可能であることを示した。
2.生物発光による細胞内カルシウム量の定量
非刺激時、KCl刺激時、その後の細胞破壊の各点で、カルシウム発光を測定した。非刺激時の細胞内カルシウムは、本研究で用いた測光系では検出できなかったが、KCl刺激によって、フラッシュ状カルシウム発光を示した、その後の過剰CaCl2による細胞破壊で、再び発光が検出できた。この結果は、細胞内には、長期カルシウム発光測定に十分なエクオリンの合成があり、細胞興奮によって一旦、小胞体やミトコンドリアから放出されたり、チャンネルを介して細胞外から流入したカルシウムにより生物発光を示すが、再取り込みなどで再び細胞内のカルシウムレベルが、測光検出閾値以下にまで低下したと考えられる。
本細胞株は、単独でも細胞内カルシウム動態のリアルタイム検出系として利用できるが、目的とする遺伝子、例えば受容体やトランスポータの遺伝子などをCo-transfectionすることにより、生細胞でのカルシウム動態のアッセイ系として利用できる。これにより、これまでfra-2などを応用できなかった、成長分化など、長期観察の必要な実験系でもカルシウム動態のリアルタイムモニタリングが可能となる。

研究成果

• [文献書誌] Honma,S.: "Circadian rhythms of arginine vasopressin and vasoactive intestinal polypeptide do not depend on cytoarchitecture of dispersed cell culture of ratsuprachiasmatic nucleus." Neuroscience. (印刷中). (1998)
• [文献書誌] Shinohara,K.: "Circadian release of amino acids in the suprachiasmatic nucleus in vitro." Neuroreport. 9(印刷中). (1998)
• [文献書誌] Yoshihara,T.: "Independence of feeding-associated circadian rhythm from light conditions and meal intervals in SCN lesioned rats." Neurosci. Lett.222. 95-98 (1997)
• [文献書誌] Nakamura,K.: "Daily melatonin intake resets circadian rhythms of a sighted man with no-24-hour sleep-wake syndrome who lacks nocturnal meltaonin rise." Psychiat.Clin.Neurosci.51. 121-127 (1997)
• [文献書誌] Nakamura,K.: "A sighted man with non-24-hour sleep-wake syndrome showed damped plasma melatonin rhythm." Psychiat.Clin.Neurosci.51. 115-119 (1997)
• [文献書誌] Hashimoto,S.: "Free-running circadian rhythm of melatonin in a sighted young man despite a 24-hr sleep pattern:a non-24-hour cicadian syndrome." Psychiat.Clin.Neurosci.51. 109-114 (1997)
• [文献書誌] Hashimoto,S.: "Midday exposure to bright light changes the circadian organization of plasma melatonin rhythm in humans." Neurosci.Lett.221. 89-92 (1997)
• [文献書誌] Kutsuna,S.: "A Period-extender gene pex that extends the period of the circadian clock in the cyanobacterium Synechococcus sp.strain PCC 7942." J. Bacteriol.(印刷中). (1998)
• [文献書誌] Kondo,T.: "Circadian rhythms in rapidly dividing cyanobacteria." Science. 275. 224-227 (1997)
• [文献書誌] AOkil,S.: "Circadian rhythm of the cyanobacterium Synechocystis sp.PCC 6803 in the dark." J.Bacteriol.179. 5751-5755 (1997)
• [文献書誌] Golden,S.S.: "Cyanobacterial circadian rhythms." Ann Rev.Plant Physiol.48. 327-354 (1997)
• [文献書誌] Honma,K.: "Excerpta Medica International Congress Series" Non-SCN rhythm in the circadian domain(印刷中), (1998)
• [文献書誌] Honma,K.: "Sleep and Sleep Disorders-from Molecule to Behavior,O.Hayaishi and S.Inoue(eds.),Academic Press," Sleep and melatonin rhythm in humans, 223-236 (1997)