超高速測光によるカリウムチャネル機能測定法の開発と応用

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08557008
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 応募区分: 試験
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 堀尾 嘉幸 大阪大学, 医学部, 講師 (30181530)
• 研究分担者: 磯本 正二郎 大阪大学, 医学部, 助手 (80273671) ; 山田 充彦 大阪大学, 医学部, 助手 (10263237)
• キーワード: 内向き整流カリウムチャネル / パッチクランプ法 / spatial buffering / RT-PCR / ミュラー細胞 / clustering / SAP97

研究概要

カリウムチャネルの機能をパッチクランプ法に加えて測定する新しい系を開発するために、まず、網膜のグリア細胞であるミュラー細胞を使ってこの細胞に発現するチャネルを分子レベルで同定をおこなった。単一の分離ミュラー細胞を用いたRT-PCRによってミュラー細胞にはK_<AB>-2チャネルが大量に発現していることが判明した。さらに、パッチクランプ法による解析でもミュラー細胞には内向き整流カリウムチャネルが1種類のみ発現しており、そのチャネルの性質は培養細胞に発現させたK_<AB>-2と全く同じ性質であることがわかった。さらに特異抗体による組織染色からもK_<AB>-2がミュラー細胞の細胞全体に広く分布しながらも膜上で、集積(clustering)して発現していることが判明した。K_<AB>-2のC末端にはPSD-95ファミリーと結合する配列があることからミュラー細胞で発現しているPSD-95ファミリーをRT-PCR法で検討した結果、SAP97が存在することがわかり、SAP97の免疫染色によってSAP97もミュラー細胞に集積して発現していること、培養細胞でK_<AB>-2とSAP97を共発現させるとK_<AB>-2が集積し、さらに、SAP97がK_<AB>-2の膜上での発現を増加させることを明らかとした。また、免疫電顕による解析の結果、K_<AB>-2はミュラー細胞が血管内皮細胞に接している部位や硝子体に面している部位に多量に発現していることを明らかとした。この特徴ある分布と外向き電流を少しながらも通すというK_<AB>-2の性質からK_<AB>-2はグリアのspatial bufferingの機構においてK+の吸い込みと放出の両方に作用している可能性が考えられた。

研究成果

• [文献書誌] Horio Y.: "Clustering and enhanced activity of an inwardly rectifying potassium channel,Kir4.1.by and anchoring protein,PSD-95/SAP 90 family." The Journal of Biological Chemistry. (in press). (1997)
• [文献書誌] Hibino H.: "ATP-dependent inwardly rectifying potassium channel,K_<AB>-2 (Kir4.1),in cochlear stria vascularis of inner ear : its specific subcellular localization and correlation with the formation of endocochlear potential." The Journal of Neuroscience. (in press). (1997)
• [文献書誌] Yamada M.: "Sulfonylurea receptor 2B and Kir6.1 form a sulfonilurea-sensitive but ATP-insensitive K^+ channel." Journal of Physiology. 499. 715-720 (1997)
• [文献書誌] Horio Y.: "Differential distribution of claasical inwardly rectifying potassium channel mRNAs in the brain : comparison of IRK2 with IRK1 and IRK3." FEBS Letters. 379. 239-243 (1996)
• [文献書誌] Isomoto S.: "A novel ubiquitously-distributed isoform of GIRK2 (GIRK2B) enhances GIRK1-expression of the G-protein-gated K^+ current in Xenopus oocytes." Biochemical and Biophysical Research Communications. 218. 286-291 (1996)
• [文献書誌] Yamashita T.: "Competition between Mg^<2+> and spermine for cloned IRK2 channel expressed in a human cell line." Journal of Physiology. 493. 143-156 (1996)
• [文献書誌] Ito M.: "Immunolocalization of an inwardly rectifying K^+ channel,K_<AB>-2 (Kir4.1),in the basolateral membrane of renal distal tubular epithelia." _FEBS Letters. 388. 11-15 (1996)
• [文献書誌] Isomoto S.: "A novel suofonylurea receptor forms with BIR (Kir6.2) a smooth muscle type ATP-sensitive K^+ channel." The Journal of Biological Chemistry. 271. 24321-24324 (1996)