単鎖DNAを抗原とするアポ-シス認識抗体の作製と発生・分化・癌化機構解明への応用

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08557013
• 応募区分: 試験
• 研究機関: 秋田大学
• 研究代表者: 杉山 俊博 秋田大学, 医学部, 教授 (00127242)
• 研究分担者: 浦山 修 秋田大学, 医学部, 助教授 (90114743) ; 高田 五郎 秋田大学, 医学部, 教授 (40047254) ; 田中 俊誠 秋田大学, 医学部, 教授 (40002216) ; 小山 研二 秋田大学, 医学部, 教授 (80004638) ; 富田 靖 秋田大学, 医学部, 教授 (70108512)
• キーワード: 単離DNA / 抗ssDNA抗体 / アポトーシス / 発生・分化 / 癌化 / DNAラダー

研究概要

1.2本鎖DNA(calf thymus)をアルカリ変性して、1本鎖DNAとメチル化ウシ血清アルブミンと混合してウサギに免疫して、抗体価の上昇した血清に熱変性サケ精子DNAを加え、免疫複合体として沈殿物を集め、抗ssDNA特異抗体を精製した。
2.得られた抗ssDNA抗体の特異性と抗体価をELISA法にて検討した結果、poly(dT),poly(dC),poly(dG-dT)およびpoly(dA-dT)と強い反応性を示した。これは本抗体がポリクローナル抗体であるため種々の塩基配列のssDNA構造を認識する抗体ポピュレーションの集合体であることを示唆した。
3.本抗体のssDNAとの結合における最小DNA鎖長は、ゲルシフトアッセイにより、本抗体がDNA上の種々の塩基配列の比較的短い単鎖領域(最小鎖6塩基)を認識することが判明した。従って、本抗体がアポトーシス細胞に特徴的なエンドヌクレアーゼ消化により生じるDNAの切断末端を検出できると結論された。
4.ラット肝より単離した核をMg^<2+>,Ca^<2+>存在下で反応させ、得られたオリゴヌクレオソームおよびそれから抽出して得たDNAを本抗体を用いてウエスタンブロットを行なったところ、DNAラダーおよびオリゴヌクレオソームをそれぞれ検出することが出来た。以上の結果より、本抗体がアポトーシス細胞を簡便に検出するプローブとして有用であることが証明された。
5.正常なラットおよびヒトの小腸上皮、胸腺、肺、肝臓、皮膚、及び胎児の組織において、本抗体を用いることによって、アポトーシス細胞を検出することが出来た。目下、種々の腫瘍細胞の癌化過程におけるアポトーシスの出現頻度を測定することにより、癌化や癌化後の増殖とアポトーシスがいかに関係しているかを検討している。

研究成果

• [文献書誌] Yasui,O.: "Isolation of oval cells from Long-Evance Cinnamon rats and their transformation into hepatocytes in vivo in the rat liver." Hepatology. 25. 329-334 (1997)
• [文献書誌] Masuda,Y.: "Platelet-derived growth factor B-chain homodimer suppressing a convulsion of epilepsy model mouse El." Biochem.Biophys.Res.Commun.223. 60-63 (1996)
• [文献書誌] Umemura,S.: "Enhancement of TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling (TUNEL) method using mung bean nuclease,a single-stranded DNA digestion enzyme." J.Histochim.Cytochem.44. 125-132 (1996)
• [文献書誌] Hirasawa,F.: "The effect of silver administration on the biosynthesis and the molecular properties of rat cerulopasmin." Biochim.Biophys.Acta. (in press). (1997)
• [文献書誌] Yamazaki,Y.: "The use of capillary liquid chromatography/electrospray mass spectrometry to identify a specific systeine residue susceptible to S-thiolation in recombinant human Cu,Zn superoxide dismutase." Res.Commun.Biochem.Cell.Biol.(in press). (1997)
• [文献書誌] Kuhara,M.: "Enhancing effect of a congenital disorder in methionine metabolism on the development of spontaneous hepatitis and hepatoma in LEC rats." J.Trace Elem.Exp.Med.(in press). (1997)