| 研究課題/領域番号 |
08557043
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| 研究種目 |
基盤研究(A)
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| 応募区分 | 試験 |
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
田代 邦雄 北海道大学, 医学部, 教授 (90002154)
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| 研究分担者 |
日比 望 株式会社エスアールエル研究部, 主席研究員
塚田 裕 株式会社エスアールエル研究部, 研究部長
森若 文雄 北海道大学, 医学部, 助教授 (30142722)
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| キーワード | 神経筋疾患 / 筋疾患マーカー / 炭酸脱水水素酵素アイソザイムIII型 / Garbonic anhydrase III / モノクローナル抗体 |
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| 研究概要 |
1)各種神経筋疾患でのCA-IIIの測定:
炭酸脱水水素酵素アイソザイムIII型(Carbonic anhydrase III、CA-III)は骨格筋格筋タイプII繊維に多く存在するcreatine kinase (CK)と異なった筋疾患マーカーといえる。CA-IIIの測定は各種神経筋疾患353件の血清で2ステップサンドイッチELISA系を用い施工した。また、非神経筋疾患の110件の血清および健常者99名(男性52名、女性52名、22〜52歳)の血清を検討対象とした。
健常者の血清CA-III濃度は対数正規分布を示し、95%信頼限界から正常上限は20ng/mlで、性別・年齢差では一定の傾向はみられなかった。
各種神経筋疾患でのCA-III濃度は、進行性筋ジストロフィー、多発筋炎で高値を示し、遠位型ミオバチ-、運動ニューロン疾患などで中等度の上昇がみられた。また、非神経筋疾患の大多数は正常もしくはごくわずかの上昇にとどまっていた。
2)抗CA-IIIモノクローナル抗体作製:等量のFCA(フロイントコンブリートアュウバンド)と混合し、エマルジョンにした抗原(CAIII)1mg/mlをBALB/Cマウス5匹に皮下注で2週間毎免疫し、脾臓又はリンパ組織を摘出した。一方、継代培養したP3U1細胞の対数増殖期の細胞をリンパ球に対して5〜4:1の割合で調製した。免疫リンパ球とP3U1細胞を遠心操作後、細胞融合し、マイクロプレートで培養した。
ELISAプレートを用い、抗体スクリーニングを行い、限界希釈法でクローニングした。増殖したハイプルド-トをBALB/Cマウスの腹腔へ移植し、腹水液を採取した。移植腹水に等量の飽和硫安を加え沈殿するγ分画を調製後、プロテインA結合カラムにてlgG分画に精製した。精製抗体の純度はSDS-PAGE12.5%(還元)にて検定した。現在まで、15クローニングを終了した。
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