プロテインSの抗血栓・抗炎症薬としての開発研究

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08557064
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 応募区分: 試験
• 研究機関: 三重大学
• 研究代表者: 鈴木 宏治 三重大学, 医学部, 教授 (70077808)
• 研究分担者: 本庄 栄二郎 日本製薬(株), 研究開発本部・東京研究部, 研究員 ; 田辺 正孝 日本製薬(株), 研究開発本部・東京研究部, 主幹研究員 ; 林 辰弥 三重大学, 医学部, 助手 (00242959) ; 武谷 浩之 三重大学, 医学部, 助手 (60222105) ; 井戸 正流 三重大学, 医学部, 講師 (90167263)
• キーワード: プロテインS / 活性化プロテインC / C4b結合蛋白質(C4BP) / モノクローナル抗体 / 抗炎症薬 / 抗血栓薬 / ELISA / 血栓症

研究概要

本研究では、抗血栓作用や抗炎症作用、線溶促進作用、細胞増殖作用、創傷治癒促進作用など多様な生物活性を有するプロテインS(PS)を、血栓症を始めとする多くの血管障害性疾患に対する治療薬として開発するための基礎研究を行うことを目的とする。そのため、(1)ヒト血漿から高純度のPSを大量に精製する方法の開発、(2)PSの抗原量および生物活性を正確に測定するシステムの開発、(3)PSのin vivoでの活性を評価する疾患モデル動物の開発、(4)PSの示す種々の生物活性の分子機構を解明する研究、(5)PS遺伝子の欠損動物の作製によるPSの発生過程等における役割の解明、の5項目について研究を行う予定である。
本年度は、先ず項目(1)について、効率的に高純度のPSを精製するため、PSの立体構造を認識するモノクローナル抗PS抗体を複数個作製した。現在、これらのモノクローナル抗体のPS分子上のエピトープを解析している。また、これらの抗体のうち、Ca^<2+>依存性に結合性を示す抗体をBrCN-Sepharose 4Bに結合された抗体カラムを作製し、ヒト血漿からPSを部分精製した。さらに、この部分精製PSをイオン交換樹脂HPLCを用いて、純度98%以上に精製した。これによって、高純度PSの精製法をほぼ確立出来たと考える(主に、日本製薬グループが担当した)。他方、項目(2)については、これまで申請者らが開発してきた遊離型PSとPS-C4BP複合体型を分別定量するELISAを、今回作製したモノクローナル抗体を用いて、より特異性と感度の高いものに改良した(三重大学グループ担当)。また、PSの生物活性評価法[活性化プロテインC(APC)コファクター活性測定法およびプロトロンビナーゼ阻害活性測定法]を改良するため、より親和性の高いモノクローナル抗PS抗体を用いたPS欠損血漿の作製、精製Xa因子、Va因子、プロトロンビンの調整を行った(主に、三重大学グループ担当)。また、現在、PSの平滑筋細胞増殖活性の測定法を確立するための準備を行っている。この後、in vivoでのPSの抗炎症活性、創傷治癒促進活性の測定法の開発を重点的課題として研究を行う。戴いた研究費の殆どは研究の遂行に必要な消耗品費等の購入に当てた。

研究成果

• [文献書誌] Gabazza EC,Takeya H,Suzuki K,et al.: "Acquired activated protein C resistance in patiens with lupus anticoaagulant and essential thrombocythemia." Clin.Appl.Thromb.Hemostas.(in press).
• [文献書誌] Gandrille S,Borgel D,Suzuki K,et al.: "Protein S deficiency:A database of mutations-1996." Thromb.Haemostas.(in press).
• [文献書誌] Deguchi H,Takeya H,Suzuki K,et al.: "Kringle 1 domain of prothrombin interacts with factor Va during the assembly of the prothrombinase complex." Biochem.J.321. 729-735 (1997)
• [文献書誌] Gabazza EC,Takeya H,Suzuki K,et al.: "Protein C activation in NIDDM patients." Diabetologia. 39. 1455-1461 (1996)
• [文献書誌] Mizutani H,Hayashi T,Suzuki K,et al.: "Functional thrombomodulin expression on epithelial skin tumours as a differential marker for suprabasal keratinocytes." Brit.J.Dermatol.135. 187-193 (1996)
• [文献書誌] Ido M,Hayashi T,Suzuki K,et al.: "Ca^<2+>-dependent activation of the 33-kDa protein kinase transmits thrombin receptor signals in human platelets." Thromb.Haemostas.76. 439-443 (1996)
• [文献書誌] Ido M,Hayashi T,Suzuki K,et al.: "Prenatal diagnosis of compound heterozygous deficiency of protein C by direct detection of the mutation sites." Thromb.Haemostas.76. 275-281 (1996)
• [文献書誌] Sun J,Yamaguchi M,Suzuki K,et al.: "Purification,characterization and cDNA clonig of a novel anticoagulant heme protein(rhodhemin)from salivary glands of blood sucking bug,Rhodnius prolixus." Thromb.Haemostas.75. 573-577 (1996)
• [文献書誌] Kise H,Nishioka J,Suzuki K,et al.: "Characterization of semenogelin II,and its molecular interaction with prostate specific antigen and protein C inhibitor." Eur.J.Biochem.238. 88-96 (1996)
• [文献書誌] Nishioka,J Ido M,Suzuki K,et al.: "The Gla^<26> residue of protein C is required for the binding of protein C to thrombomodulin and endothelial cell protein C receptor,but not to protein S and factor Va." Thromb.Haemostas.75. 275-282 (1996)
• [文献書誌] Mizutani H,Hayashi T,Suzuki K,et al.: "Increased endothelial and epidermal thrombomodulin expression and plasma thrombomodulin level in progressive systemic sclerosis." Acta Med.Okayama. 50. 293-297 (1996)
• [文献書誌] Mori T,Takeya H,Suzuki K et al.: "β_2-Glycoprotein I modulates anticoagulant activity of activated protein C on phospholipids." Thromb.Haemostas.75. 49-55 (1996)
• [文献書誌] Tamei H,Hoshino T,Suzuki K,et al.: "One-step sandwich enzyme immunoassay for human C4b-binding protein(C4BP)and protein S-C4BP complex using monoclonal antiodies." Clin.Chim.Acta. 234. 115-125 (1995)
• [文献書誌] Ohnishi K,Nagata K,Suzuki K,et al.: "Stimulation of Sky receptor tyrosine kinase by the product of growth-arrest-specific gene 6." J.Biol.Chem.270. 22681-22684 (1995)
• [文献書誌] Hayashi T,Nishioka J & Suzuki K.: "Molecular mechanism of dysfunctional protein S-Tokushima(Lys^<155>→Glu)in the regulation of blood coagulation." Biochim.Biophys.Acta.1272. 159-167 (1995)
• [文献書誌] Iino M,Takeya H & Suzuki K.: "Characterization of factor Xa binding to fibrinogen/fibrin derivatives. Comparative study with thrombin binding." Eur.J.Biochem.232. 90-97 (1995)
• [文献書誌] Yasuda H,Hayashi T & Suzuki K.: "Molecular cloning and functional characterization for rat plasma protein S." J.Biochem.117. 374-383 (1995)
• [文献書誌] Nakagawa H,Takahashi N,Suzuki K,et al.: "A structural study of the oligosaccharide moeities of human coagulation factor X activation peptide." Glycoconjugate J.12. 173-181 (1995)
• [文献書誌] 鈴木 宏治: "分子細胞生物学辞典" 東京化学同人(村松 正実 他編), 1040 (1997)
• [文献書誌] 鈴木 宏治: "臨床検査 増刊-血栓症と血小板凝固線溶系検査-(プロテインC、プロテインS、APC・PCI複合体)" 医学書院(猪狩 淳 他編), 292(13) (1996)
• [文献書誌] 鈴木 宏治: "臨床検査ガイド'96(プロテインC、プロテインS、APCレジスタンス、トロンボモジュリン)" 文光堂(Medical Practice編集委員会 編), 1061(8) (1996)
• [文献書誌] 鈴木 宏治: "図説 分子病態学" 中外医学社(一瀬白帝、鈴木宏治 編), 553 (1995)
• [文献書誌] Suzuki K.: "Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis(Protein C)" Marcel Dekker,Inc,New York(eds.Roberts HR & High KA), 688(31) (1995)
• [文献書誌] Suzuki K.: "Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis(Protein S)" Marcel Dekker,Inc,New York(eds.Roberts HR & High KA), 688(19) (1995)