任意組織における高効率遺伝子破壊システムの開発

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08557065
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 応募区分: 試験
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 竹田 潤二 大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (50163407)
• 研究分担者: 坂田 恒昭 株式会社, ディナベック研究所, 室長(研究者) ; 中西 真人 大阪大学, 微生物病研究所, 助教授 (10172355)
• キーワード: コンディショナルジーンターゲティング / 血液幹細胞 / 膜融合リポソーム / Cre / loxP / Pig-a

研究概要

生命現象に必須の遺伝子の機能を個体レベルで解析するためには、通常の遺伝子破壊ではなく着目したそしきあるいは時期だけで遺伝子を破壊する必要性がある。そういった必要性を満たすシステムとしてCre/loxPを利用したコンディショナルジーンノックアウトが注目を浴びている。Creリコンビネース発現法は、主にCre transgenic mouseを利用する内在性に発現させる方法と、ウイルスベクターあるいは非ウイルスベクターを利用する外来性発現法がある。本研究では外来性に、Creを任意の組織あるいは時期に発現できるシステムを開発し、個体レベルで遺伝子機能を解析するのが、最終目標である。
・非ウイルスベクターである膜融合リポソームの作成と血液幹細胞への蛋白導入
核移行シグナルを有したCre蛋白を大腸菌で大量発現させ、膜融合リポソームを作成した。loxP部位を有したPrimary fibroblastに導入すると、Cre蛋白依存性に遺伝子破壊が確認された。次に、loxP部位を有した骨髄細胞を取り出し、Cre蛋白を組み込んだ膜融合リポソームと混合した。混合直後にPCRにて遺伝子破壊が起きている事が確かめられた。その遺伝子破壊が骨髄の血液幹細胞でも起きているかどうかを、致死量の放射線照射したマウスに移入することにより確かめているところである。

研究成果

• [文献書誌] Reika Watanabe et al.: "PIG-A and PIG-H,which participate in glycosyl phosphatidyl-inositol anchor biosynthesis,form a protein complex in the endoplasmic reticulum." Journal of Biological Chemistry. 271・43. 26868-26875 (1996)
• [文献書誌] Norimitsu Inoue et al.: "PIG-C,one of the three human genes involved in the first step of glycosylphosphatidylinositol biosynthesis is a homologue of Saccharomyces cerevisiae GPI2." Biochemical and Biophysical Research Communications. 226. 193-199 (1996)
• [文献書誌] Minoru Takahashi et al.: "PIG-B,a membrane protein of the endoplasmic reticulum with a large lumenal domain,is involved in transferring the third mannose of the GPI anchor." The EMBO Journal. 15・16. 4254-4261 (1996)
• [文献書誌] Ohishi,K.: "Cloning and characterization of the murine GPI anchor synthesis gene Pigf,a homologue of the human PIGF gene." Genomics. 34. 340-346 (1996)