遺伝子導入用リポソームの開発とその応用

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08557082
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 応募区分: 試験
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 吉田 純 名古屋大学, 医学部, 教授 (40158449)
• 研究分担者: 水野 正明 名古屋大学, 医学部, 助手 (70283439) ; 妹尾 久雄 名古屋大学, 環境医学研究所, 教授 (40135380)
• キーワード: リポソーム / 遺伝子 / 安全性 / 純度検定

研究概要

リポソームに細胞特性を持たせるための蛋白としてアシアロ蛋白をカチオニックリピッド(N-(α-トリメチルアンモニオアセチル)-ジドデシル-D-グルタメイトクロリド(TMAG)を含むリポソームに取り込ませ、ヒト肝癌細胞HepG2を標的として遺伝子導入を試みた、その結果、β-galactosidase活性として2-5倍の増強効果が得られた。またアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターをリポソームに包埋することで発現効率は2-4倍増強した。これにより特異性のないAAVベクターに細胞特異性をもたせることが可能となった。
一方で臨床研究に使用可能な遺伝子導入用リポソームの調製を目指し、プラスミドの大量調製法と純度検定法を確立した。プラシミドの大量調製法としてQIAGEN社製Plasmid Max KitあるいはUltrapure100カラムを採用した。米国での検定法を参考に純度検定法を以下のように考案した。(1)吸光スペクトル(A260/A280)は1.75-2.0、(2)DNA濃度は90%以上、(3)大腸菌由来のDNAはサザンブロット法により定量し、2%以下、(4)タンパク質はビシンコニン酸法により定量し、1%以下。そしてこれらの基準をすべてクリアするプラスミドの調製に成功した。さらにこの遺伝子を用いてリポソームを調製し、最終産物である遺伝子包埋リポソームの均一性を検討後、安全性試験をラットおよび犬で行い、良好な結果を得た。

研究成果

• [文献書誌] Sadatomo T.,Yoshida J.et al.: "New approach for the treatment of medulloblastoma by transfection with glial fibrillary acidic protein gene." Surgical Oncology. 5. 69-75 (1996)
• [文献書誌] Okada H.,Miyamura K et al.: "Gene therapy against an experimental glioma using adeno-associated virus vectors." Gene Therapy. 3. 957-964 (1996)
• [文献書誌] Yoshida J.: "Molecular neurosurgery using gene therapy to treat malignant glioma." Nagoya J.Med.Science. 59. 97-105 (1996)
• [文献書誌] Yoshida J.,Wakabayashi T.et al.: "Cytokine gene therapy of malignant glioma by means of DNA/liposomes." Brain Tumor Res.1. 423-434 (1996)