新規オステオニューロトロフィンの分子クローニングと骨・軟骨疾患治療薬としての応用

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08557098
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 滝川 正春 岡山大学, 歯学部, 教授 (20112063)
• 研究分担者: 牧島 房夫 ヘキストジャパン研究所, 代謝骨疾患部門, 主席研究員 ; 高橋 浩二郎 岡山大学, 歯学部, 助教授 (00144775) ; 中西 徹 岡山大学, 歯学部, 助手 (30243463)
• キーワード: ニューロトロフィン / コンドロニューロトロフィン / 神経栄養因子 / trk / 骨 / 軟骨 / 結合組織増殖因子(CTGF)

研究概要

1)ニューロトロフィン(NT)-3はtrkCを介して骨芽細胞核内のTRE,SRE等のDNA結合タンパク質、特にAP-1の量を増加させた。また、アスコルビン酸は骨芽細胞のNT、特にNT-3の発現を促進した。
2)ヒトおよびマウスのCTGF/Hcs-24を高感度で定量可能なサイドイッチELISA法を確立した。
3)抗CTGFペプチド抗体を用いた免疫染色で、大脳皮質の一部の神経細胞や海馬のアストログリア細胞が陽性であった。In situ hybridizationでは脊髄の運動神経や三叉神経節の神経細胞で強い発現が見られた。
4)HCS-2/8細胞を材料源としてnativeなCTGF/Hcs-24を精製した。さらに、HeLa細胞を用いてリコンビナントCTGF(rCTGF)発現系を確立した。
5)精製CTGFおよびrCTGFは軟骨細胞の増殖を促進し、プロテオグリカン合成およびアルカリホスファターゼ活性を上昇させた。また、rCTGFはニワトリ胚大脳グリア細胞の増殖を促進した。さらに、血管内皮細胞の増殖と遊走を亢進させた。以上の結果はCTGFがコンドロニューロトロフィン(CHNT)であることを示している。
6)^<125>I-rCTGFを用いて結合実験およびクロスリンク実験を行い、HCS-2/8細胞に特異的レセプターの存在を証明した。
7)CHNT/CTGF遺伝子のトランスジェニックスマウスを作成するのに成功した。
8)NTの一つNGFとその受容体trkAのmRNAが骨細胞に認められた。
9)マウス骨折モデルにおいて骨折2日後にtrkAやtrkCの発現が増強し、また、NGFおよびNT-3 mRNAの発現も増大した。
10)PC12D細胞においてアセチルコリンレセプターのアゴニストであるカルバコールによってCTGFの発現が亢進した。
11)マウス歯根膜細胞(MPL)におけるNGF,BDNFおよびNT-3の発現はconfluentに達するにしたがって増加したが、TRKレセプターの発現は低下傾向を示した。また、CTGFの発現も低下した。
12)神経突起伸展作用を有するIGF-IおよびIIがそれぞれのレセプターを介してHCS-2/8細胞のプロテオグリカン合成を促進した。

研究成果

• [文献書誌] Nakanishi,T.: "Cloning of a mRNA preferentially expressed in chondrocytes in differential display PCR from a human chondrocytic cell line that is identical with connective tissue growth factor(CTGF)mRNA." Biochem.Biophys.Res.Commun.234. 206-210 (1997)
• [文献書誌] 滝川正春: "平成8年度骨粗鬆症財団研究助成:神経栄養因子の機能を介する骨粗鬆症の予防法の確立-培養骨芽細胞を用いた各種ビタミンの効果に関する基礎的検討-。" Osteoporosis Japan. 604-608 (1997)
• [文献書誌] Takigawa,M.: "Insulin-Like Growth Factors I and II Are Autocrine Factors in Stimulating Proteoglycan Synthesis,a Marker of Differentiated Chondrocytes,Acting through Their Respective Receptors on a Clonal Human Chondrosarcoma-Derived Chondrocyte Cell Line,HCS-2/8." Endocrinology. 138. 4390-4400 (1997)
• [文献書誌] Takigawa,M., Kimura,Y. and Takahashi,K.: "The basic effect of IGF on chondrocytes." Clin.Pediatr.Endocrinol.6(Suppl 10)(in press). (1997)
• [文献書誌] 滝川正春: "基礎からみた整形外科領域のサイトカイン。" 整形・災害外科. 41. 3-12 (1998)
• [文献書誌] 滝川正春: "内軟骨性骨形成に最も重要な新規成長因子CTGF。" 細胞工学. 17. 357-362 (1998)