歯周疾患の新しい診断法の開発-歯肉溝滲出液中のhHGFの動態と病態の検討-

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08557100
• 研究種目: 基盤研究(A)
• 応募区分: 試験
• 研究機関: 鹿児島大学
• 研究代表者: 大工原 恭 鹿児島大学, 歯学部, 教授 (40028733)
• 研究分担者: 町頭 三保 鹿児島大学, 歯学部・附属病院, 助手 (80253897) ; 大西 智和 鹿児島大学, 歯学部, 助手 (30244247) ; 新垣 尚捷 鹿児島大学, 歯学部, 助教授 (60151148)
• キーワード: 肝細胞増殖因子 / HGF / 上皮細胞分散因子 / SF / ELISA / 高感度化 / 歯周疾患

研究概要

平成8年度は、以下により主としてhHGF測定法の高感度化を試みた。
1.研究代表者らが開発し、現在臨床で応用されているhHGFのELISA系を基礎として、標識酵素をb-ガラクトシターゼに変え、人工蛍光色素を基質に用いて、本年度の補助金で購入したマイクロプレート用蛍光光度計により測定したが、期待した程の感度は得られなかった。
2.そこで、さらに親和性の高い抗体を調製するために組換え体hHGFを抗原としてニワトリを免疫し、その卵から抗ヒトhHGFIgYを得た。
3.抗ヒトhHGFIgYはカラゲニン処理及び組換え体hHGFによるアフィニティ精製を行い、さらにペプシン処理によりFab'を調製してペルオキシダーゼにより標識した。
4.上記の抗ヒトhHGFIgY及びマウス抗hHGFモノクローナル抗体によりサンドイッチ法によるELISA系を組んだところ、現在のものより約10倍高感度のものが得られた。
5.これにより、標識酵素をb-ガラクトシターゼに変えれば、さらに感度を約100倍上昇させることが出来る目途がついた。
6.現在は、上記5を実施するために、抗ヒトhHGFIgYの大量精製を行っている段階である。
7.今後の課題としては、(1)上記高感度hHGF ELISAの特異性の検討、(2)IgYのより効率的な精製法の検討、(3)IgYのFab'にβ-ガラクトシダーゼをより効率的に標識する方法の開発があるが、次年度以降さらに精力的に研究を進める方針である。これにより、歯肉溝滲出液のみならず尿中などの微量のhHGFも測定も可能となるものと期待される。
8.上記の研究の他、本年度はHGFに関して裏面に示す6編の論文を発表した。

研究成果

• [文献書誌] Eagles,G.: "Hepatocyte growth factor/scatter factor is present in most pleural effusion fluids from cancer patients." Br.J.Cancer. 73. 377-381 (1996)
• [文献書誌] Sugiyama,A.: "Lipoteichoic acid interleulin 1 stimulate synergistically production of hepatocyte growth factor (scatter factor) in human gingival fibroblasts in culture." Infect.Immun.64. 1426-1431 (1996)
• [文献書誌] Shao,Q.: "Effect of hepatocyte growth factor/scatter factor on lipogenesis in adult rat hepatocytes in primary culture." J.Biochem. (Tokyo). 119. 940-946 (1996)
• [文献書誌] Miyata,K.: "Levels of human hepatocyte growth factor (hHGF) in peritoncal fluid after partial hepatectomy." Hepato-Gastroenterol.43. 1594-1600 (1996)
• [文献書誌] D'Errico,A.: "Liver hepatocyte growth factor does not always correlate with hepatocellular proliferation in human liver lesions : Its specific receptor c-met dose." Hepatology. (印刷中). (1997)
• [文献書誌] Ohnishi,T.: "Effect of phosphorylated rat fetuin on the growth of hepatocytes in primary culture in the presence of human hepatocyte growth factor-scatter factor (HGF/SF)." Eur.J.Biochem.(印刷中). (1997)