蛍光色素を用いた細胞内情報伝達過程イメージングシステムの開発

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08558084
• 研究機関: 東京薬科大学
• 研究代表者: 工藤 佳久 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (20080179)
• 研究分担者: 東 秀好 三菱化学, 生命科学研究所, 主任研究員 ; 内山 茂 浜松ホトニクス(株), スシテム事業部, 研究員 ; 森田 光洋 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (50297602) ; 中村 健 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (50227906) ; 宮川 博義 東京薬科大学, 生命科学部, 助教授 (90166124)
• キーワード: 蛍光色素 / イメージング / 情報伝達 / プロテインキナーゼ / cAMP / Ca^<2+>

研究概要

本年度は昨年に引き続き情報伝達系の可視化試薬の創製およびその基礎研究を行った。
i)CaMKII可視化試薬の改良:昨年までに創製したCaMKIIの特異的基質ペプチド、Syntide-2に蛍光指示薬acrylodanを結合させた試薬、AS2について特異的基質ペプチドの酵素分解に対する抵抗性を高めた。すなわち、構成アミノ酸の内、peptidaseの作用部位と考えられる2位のLeuをD-Leuに置換した試薬(DLAS)である。この試薬を海馬培養細胞に負荷にして刺激時の酵素活性の変化を蛍光画像処理法によって解析した結果、リン酸化速度はやや遅いものの20分間程度の計測には充分耐えることが判明した。
ii)cAMP依存性キナーゼ活性化検出試薬およびcalcineurin活性化検出試薬の合成:PKA-regulatory domeinIIの19個のアミノ酸残基を合成し、これにacrylodanを結合させた試薬、ARIIの合成、さらにこのARIIのリン酸化産物P-ARIIを合成した。これらを海馬培養細胞に負荷して、PKAの活性状態及びprotein phosphatase、calcineurinの活性化状態を画像処理によって計測した。
iii)cAMP検出試薬の創製:cAMP可視化試薬を創製することを目的としてPKA-regulatory domein上のcAMP結合部位のアミノ酸17個を合成した。これに蛍光試薬を結合した試薬を合成したがcAMP結合による蛍光変化は見られなかった。そこで、金電極にこの試薬を結合してボルタノメトリーでcAMPの計測を行い、このペプチドが確かにcAMPを結合することを確かめた。

研究成果

• [文献書誌] Higashi,H., Sato,K., Omori,A., Sekiguchi,M., Ohtake,A.and Kudo,Y: "Imaging of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II in hippocampal neurons" Neruo Report. 7. 2695-2700 (1997)
• [文献書誌] Uchino,S., Kudo,Y., Watanabe,W., Nakajima-Iijima,S and Mishina,M.: "Inducible expression of N-methyl-D-aspartate(NMDA)receptyor channels from cloned cDNA in CHO cells" Mol.Brain Res. 44. 1-11 (1997)
• [文献書誌] Higashi,H., Sato,K., Ohtake,A., Omori,A., Yoshisa,S.and Kudo,Y.: "Imaging of cAMP-dependent protein kinase activity in living neural cells using a novel fluorescent substrate" FEBS Letters. 414. 50-60 (1997)
• [文献書誌] Katayama,Y., Ohuchi,Y., Nakayama,M., Maeda,M., Higashi,H.and Kudo,Y.: "Cyclic AMP detection by electrode modified with 17mer oligopeptide." Chem.Lett.(印刷中).
• [文献書誌] 工藤 佳久、森田 光洋、東 秀好(共著): ""脳機能の解明"-21世紀に向けて-" 赤池紀扶等編集 九州大学出版会, 615 (1998)
• [文献書誌] 工藤佳久(共著): "バイオイメージング" 曽我部正博、臼倉治郎編集 共立出版, 266 (1998)