| 研究課題/領域番号 |
08558084
|
|---|
| 研究種目 |
基盤研究(A)
|
| 配分区分 | 補助金 |
|---|
| 応募区分 | 展開研究 |
|---|
| 研究分野 |
神経科学一般
|
|---|
| 研究機関 | 東京薬科大学 |
|---|
研究代表者 |
工藤 佳久 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (20080179)
|
|---|
| 研究分担者 |
内山 茂 浜松ホトニクス(株), システム事業部, 研究員
東 秀好 三菱化学生命科学研究所, 主任研究員
森田 光洋 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (50297602)
中村 健 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (50227906)
宮川 博義 東京薬科大学, 生命科学部, 助教授 (90166124)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
1996 – 1998
|
| キーワード | Ca^<2+> / カルモデュリン依存性キナーゼ / カルシウムイオン / CAMP依存性キナーゼ / CAMP / 蛍光試薬 / 冷却CCD / ペプチド試薬 / 神経細胞 |
|---|
| 研究概要 |
蛍光Ca2+指示薬による細胞内Ca2+濃度の画像による解析法が利用できるようになって、生細胞内の特定分子のダイナミックな活動様式を可視化を試みる研究に拍車がかかった。というのも、この方法を使えば特定の機能分子の細胞内で、部位特性や活性化時間など新しい情報を提供してくれるからである。このプロジェクトにおいて我々は細胞機能のダイナミックな調節に最も重要な酵素である二種のリン酸化酵素の活性を直接可視化する特異的指示薬を作り出すことおよび微弱な蛍光の変化を確実に解析するシステムを構築することにを目的とした。最初にCa+/カルモデュリン依存性キナーゼ(CaMKII)活性の可視化のためにCaMKIIの特異的基質ペプチド、Syntide2のN-末端に蛍光指示薬、Acrylodanを結合させた試薬、AS2を創製し、まず、試験官内でこの試薬がCa2+で活性化されたカルモデュリンとそれによって活性化されるCaMKIIの有効な指示薬になることを確かめた。一方、cAMP依存性キナーゼ(PKA)の活性を可視化するためにこの酵素の調節ドメインのPKAによる自己リン酸化部位(Domain II)に着目し、その部分ペプチドを合成し、これをPKAの基質とした。この基質ペプチドのC-末端に蛍光物質、Acrylodanを結合させた化合物、ARIIを創製した。このARIIはPKAによって特異的にリン酸化され、それにともなって蛍光強度が減少した。AS2とARIIは培養神経細胞内でも同様な蛍光の変化を示し、刺激によって、極めて局所的に活性化される様子を画像化することに成功した。さらに、本研究期間中にこれらの色素の安定性や感度、細胞内透過性などを改良した数種の試薬を創製することに成功した。
|
