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ACh合成酵素、コリン・アセチル基転移酵素(ChAT)は、コリン作動性ニューロンの特異的なマーカーである。我々が作成したラットのChATに対する抗血清は、サカナからヒトに至る脊椎動物のChATと免疫組織化学的に交叉する。本研究では、この抗血清を用いた免疫組織化学により、脊椎動物におけるコリン作動性ニューロンの系統発生学的・比較解剖学的研究を行うことを目的としている。ところが最近、ChATと同様コリン作動性ニューロンの特異的なマーカーと考えられる。軸索終末でAChをシナプス小胞に取り込む作用を持つ小胞AChトランスポーター(VAChT)を呼ばれる膜蛋白の遺伝子構造が明らかにされた。そこでラットのVAChTに対する抗血清を作成し、この抗血清も本研究に使用できるか否か検討した。先ずWestern blotにより、その特異性を確認した。次いで、ChATとVAChTにそれぞれ特異的なRNAプローブおよび抗血清を用い、隣接切片あるいは同一切片で、in situ hybridizationや免疫組織化学を行い、両者はラットの中枢神経系において遺伝子および蛋白レベルで、ほとんど全てのコリン作動性ニューロンで発現されることを明らかにした。免疫組織化学的には、ChATは細胞体、樹状突起や軸索をよく染めるが、VAChTは軸索終末を著しく強く求める。このVAChTに対する抗血清は、パラフィン切片での染色も可能で、サルやヒトのVAChTと免疫組織化学的に交叉し、広い種交叉性が期待し得る。現在、ChATおよびVAChTの抗血清を併用し、本研究課題を遂行しているところである。
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