| 研究課題/領域番号 |
08650951
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 名古屋市立大学 |
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研究代表者 |
野原 大輔 名古屋市立大学, 薬学部, 助教授 (60080214)
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| 研究分担者 |
栗本 英治 名古屋市立大学, 薬学部, 助手 (90234575)
黒田 良孝 名古屋市立大学, 薬学部, 講師 (40080204)
酒井 朝也 名古屋市立大学, 薬学部, 教授 (00080169)
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| キーワード | タンパク質 / リフォールディング / 固定化法 |
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| 研究概要 |
(1)サチライシンをCNBr-activated Sepharose4Bにアミノ基あるいはカルボキシル基で固定化した2種類の固定化サチライシンを調製し、これらを変形(pH2.4の6Mグアニジン塩酸塩溶液による)および再生操作を繰り返し施し、定量的なrefoldingのできるサンプルを得た。この定量的refoldingできる標品を用いて様々な種類のrefolding溶液による再生操作を行い、サチライシンのrefoldingに対する有効さを評価した。その結果、固定化法の種類によらずサチライシンのrefoldingには高濃度のプロピオン酸カリウム、酢酸カリウムなどの有機酸塩が大変有効であることがわかり、これらに反して塩化リチウムや塩化ナトリウムなどの塩では殆ど活性回復しなかった。固定化法の種類によらず同様の結果を示したことにより固定化法というものがrefolding溶液選定のための有効な手段であることが明らかとなった。
(2)また、同じくプロテアーゼであるサーモライシンを固定化したものも調製し、これに対してもpHを下げ、6Mグアニジン塩酸塩溶液を適用することで完全な変性条件を得ることができた。サーモライシンについても様々な種類のrefolding溶液の評価を行ったところ、若干の違いはあるもののサチライシンの場合とよく似た結果が得られた。リゾチームやリボヌクレアーゼなどの再生にはこうした高濃度の有機酸塩は全く効果がない。リゾチームやリボヌクレアーゼなどと異なりサチライシン、サーモライシンとも分子の3次元構造に疎水性のコアが存在することから、似通った有機酸塩の溶媒が疎水部分を分子内側に追い込んでいく効果をおよぼしたと考えられる。
(3)この他、サーモライシンに対する阻害剤としてフォスフォラミドンを採り上げ、これによる阻害の様子を調べた。
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