| 研究概要 |
1.マイクロプレートハイブリダイセーション法(以下MPH)に基づく遺伝子診断法の実用化上キ-ポイントとなる諸条件、即ち(1)マイクロプレートへの被検核酸分子の吸着条件、(2)ハイブリダイゼーション条件及び(3)検出用プローブの非放射性標識方法の検討を行った。その結果、被検試科の変性方法はホルムアミド50%、ホルムアルデヒド6.125%、1XSSC中で68C、10分の加熱が最も優れていることを明らかにした。また、ハイブリダイゼーション条件の検討により、従来のメンブレンを用いた手法に比べプレハイブリダイゼーション処理、ハイブリダイゼーション液中のブロッキング試薬(tRNA,salmonsperm DNA)等が省略できることを明らかにし、手法を簡便化した。さらにジゴキシゲニン(DIG)標識したcRNAブローブと安価な発色基質を用いることにより検出感度を低下させることなく、診断コストを大幅に削減した。以上の結果ほぼELISA並の操作と設備で実用的な遺伝子診断を行うことが可能になった。
2.ウイルス純化試料及び簡単な抽出方法で調整したホップ潜在ウイルス(HLV)RNAを用いて、ELISAとの感度比較を行った結果、純化ウイルスを用いた場合で約100倍、粗抽出液を用いた場合でも40倍以上MPHがELISAより高感度であり、特に純化精製が困難で優れた抗血清の得にくいウイルスではMPHが非常に効果的であることを明らかにした。
3.種々の植物ウイルス、ウイロイドの診断用プローブの開発を行い、ウイロイドでHSVd、CEVd、ASSVd、PBCVd、PSTVd、HLVd、CbVd1、GYSVd、CSVd及びCVdIIIの10種類、ウイルスではCMV、CMV-satellite RNA、HLV、TuMV、WCMV、MNSV、PVY、HMVの8種類の合計を18種類の植物ウイルス、ウイロイド診断用プローブを開発した。
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