キメラタンパク質によるイネ培養細胞低温性のアミラーゼの性質支配領域の解析

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08660085
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 中島 佑 東北大学, 農学部, 教授 (20091720)
• キーワード: α-アミラーゼ / イネ培養細胞 / タンパク質工学 / キメラタンパク質

研究概要

イネ(ササニシキ)培養細胞に特異的に発現している低温性αアミラーゼの性質支配領域を決定する目的で、前年(H8年)度は常温性αアミラーゼ(アミラーゼIII)と低温性のアミラーゼ(アミラーゼIII)の非相同領域を組換えたキメラ遺伝子を作成し酵母(Saccharomyces cerevisiae)で発現したところ、アミラーゼIの性質を示すタンパク質は酵母より分泌されたがアミラーゼIIIの性質を示すタンパク質は分泌されず、性質の決定が困難と思われたため、本年(H9年)度は大腸菌での発現系を構築し、両酵素及びアミラーゼI・IIIを組換えた8種のキメラタンパク質の発現と生産をおこなうことに成功した。それぞれのキメラタンパク質の性質の解析から、4個所の非相同領域のうち、第3番目の領域がアミラーゼの低温性を支配していることを明らかにした。この非相同領域は常温性のアミラーゼIでは、α-ヘリックスをとっているのに対し、低温性のアミラーゼIIIではβ-シート構造をとっていることが、Chou-Fasmanの2次構造予測からも示された。この領域はアミラーゼの二つの活性中心残基ASp176,Glu201にはさまれた領域で活性中心の近傍に位置しており、アミラーゼIIIの触媒機構に影響をおよぼすものと考えられる。またこの領域内にあるアミノ酸のうち、Pro180は常温性のアミラーゼIとは異なるアミノ酸で、イミノペプチド結合を形成するイミノ酸であることから、立体構造にひずみをあたえ、酵素の性質を変化させた可能性が考えられる。

研究成果

• [文献書誌] T.Yoshida,: "Overexdression of 1,2-a-mannosidase,a glycoprotein processing enzyme,by Aspergillus oryzae." Biosci.Biotechnol.Biochem.,. 61,(印刷中). (1998)
• [文献書誌] T.Mio,: "Isolation of the Candida albicans Homologs of Saccharomyces cerevisias KRE6 and SKNI;Expression and physiological function," J.Bacteriol.,. 179(7). 2363-2372 (1997)
• [文献書誌] T.Nakajima,: "Purification and characterization of an endo α-1,3-D-mannanase from Flavobacterium sp." Biosci.Biotech.Biochem.,. 60(10),. 1743-1746 (1996)
• [文献書誌] T.Mio,: "Role of three chitin synthase genes in the growth of Candida albicans," J.Bacteriol.,. 178(8),. 2416-2419 (1996)
• [文献書誌] T.Yabe: "HKRI encodes a cell surface protein that regulates both cell wall β-glucan synthesis and budding pattern inthe yeast Saccharomyces cerevisiae," J.Bacteriol.,. 178(2). 447-483 (1996)
• [文献書誌] T.Nakajima,: "Chemical structure of the galactomannan moiety in the cell wall glycoproteins of Aspergillus oryzae," J.Ferment.Bioeng.78(6),. 472-475 (1994)