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B.cereus胞子の発芽時に現出する胞子コルテックス分解酵素の構造並びにその活性化機構の解明を試み、本年度においては以下の成果を得た。
1 B.cereus由来の胞子コルテックス分解酵素の遺伝子のクローニング:本酵素は精製される酵素量が極めて少ないため、これまでその構造に関する知見を得るのが困難であった。そこで、本酵素の遺伝子クローニングを行いその全一次構造を推定したところ、本酵素はシグナルペプチドを有する分泌蛋白質であり、休眠胞子中で成熟体として存在することが示唆された。また、本酵素遺伝子は胞子形成開始約3時間後に転写開始されること、及び転写物の大きさと転写開始点の解析から本酵素遺伝子と3'-下流に隣接するオープンリーディングフレームがオペロンを形成することを明らかにした。
2 クローン化したB.cereus胞子コルテックス分解酵素の大腸菌による発現:クローン化した遺伝子の組み換えによる部位特異的変異体を作製して大腸菌に発現させたところ、酵素に唯一存在するシステイン残基が活性中心ではないものの活性に重要な役割をしていることを明らかにした。
3 B.cereus胞子コルテックス分解酵素の枯草菌における相同遺伝子の解析:B.cereus胞子コルテックス分解酵素の枯草菌における相同遺伝子をクローン化して全構造遺伝子の塩基配列を決定した。また、当該遺伝子の欠損株を作製することにより、本酵素が枯草菌胞子のL-アラニンによる発芽に特異的に応答することを明らかにした。
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