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(1)VP1/ABI3の高度保存領域と相同性を示すアラビドプシス遺伝子の解析
トウモロコシ、イネおよびアラビドプシスのVP1/ABI3間で、そのC末端ドメインは高度に保存されている。この様な高度保存領域の機能を明らかにすることは、VP1を介したABA応答性転写制御のメカニズムを明らかにする上で重要であると考えられる。昨年度我々は、アラビドプシスESTクローン中にこの保存領域と相同性を示すものを見つけ、その全長cDNA、VAL1およびVAL2をクローン化したところ、VP1/ABI3保存領域は、VAL1/2のC末端領域に存在しており、N末端領域には、エチレン応答性エレメント結合タンパク質(EREBP)やAPETALIA2遺伝子産物のDNA結合ドメインと考えられている領域と相同性を示す配列が存在していることを明らかにした。本年度は、Random sequence oligonucleotideを用いたbinding site selectionにより、VAL1の認識配列を明らかにした。この配列を用いてVAL1の各ドメインとDNA結合能の関係を調べたところ、VP1/ABI3ドメインとAP2ドメインの両方が特異的なDNA結合に必要である事が明らかとなった。このことから、VP1/ABI3高度保存領域がDNA配列認識/結合機能を持っており、これまでの予想に反してVP1もDNAに直接接触する可能性が示唆された。
(2)VP1と相互作用するタンパク質の解析
"Two-hybrid"システムを用いてVP1/ABI3ドメインと相互作用する可能性があるタンパク質cDNAクローン化した。このクローンがコードするタンパク貿CANDY22(仮称)は、in vitroにおいてもVP1と特異的に結合した.CANDY22のN末端側には、酵母からヒトに至るまでの様々なタンパク質に共通して見られる配列が含まれていた。この様な共通配列を持つタンパク質にはSH3ドメインやITAMドメインといったシグナル伝達アダプタータンパク質にみられる構造を含むものもあり、CANDY22も何らかのシグナル伝達因子であると考えられた。また、CANDY22-GFP融合タンパク質をタマネギ表皮細胞でトランジエントに発現させたところ、細胞質と核内の特定の構造への局在化が見られた。
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