| 研究課題/領域番号 |
08670023
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| 研究機関 | 宮崎医科大学 |
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研究代表者 |
川野 純一 宮崎医科大学, 医学部, 助手 (10136822)
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| 研究分担者 |
井手 惣幸 宮崎医科大学, 医学部, 教務職員 (20244212)
生沼 勉 宮崎医科大学, 医学部, 助手 (20168842)
菅沼 龍夫 宮崎医科大学, 医学部, 教授 (60115350)
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| キーワード | ゴルジ装置 / マーカータンパク質 / モノクローナル抗体 / Schneider line2細胞 / キイロショウジョウバエ / S2細胞 / 細胞分画 / ライソゾーム |
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| 研究概要 |
我々は新しいゴルジ装置のマーカータンパク質を発見するために、昆虫細胞からゴルジ装置を分離し、これを抗原としてゴルジ装置を特異的に認識するモノクローナル抗体の作成を試みた。まず実験材料として、sf9、sf21、High5、Schneider line2(S2)、Kcの5種の細胞について、培養条件とゴルジ装置の形態を検討した。その結果、比較的簡単に浮遊培養で大量培養ができること、ゴルジ装置の発達が良いこと、また遺伝学の材料として良く使われるキイロショウジョウバエ由来であることから、S2細胞を材料に選んだ。Cluet and Brown(1992)の方法に準じて蔗糖密度勾配法による細胞分画を行い、各分画のタンパク質と核酸の含有量と、arylmannosidase活性の測定と電子顕微鏡観察を行った。ゴルジ装置は蔗糖濃度0.9Mから1.1Mの間に比較的高い精製度で分画されることが分かった。この分画を炭酸ナトリウム処理したものをマウスに腹腔内注射して免疫し(0.3-0.5mgタンパク質x4回)、バイブリド-マを作成した。約2000の培養上清をS2細胞の免疫蛍光でスクリーニングした結果、約60%の上清が何らかの染色を示した。しかし、これらのほとんどはライソゾームかエンドゾームを染色しており、明かにゴルジ装置だけを認識しているものは見つからなかった。ゴルジ装置局在性タンパク質に比べてライソゾーム膜タンパク質が高い抗原性を持っていることが哺乳類で知られている。恐らく昆虫細胞においても同様で、今回の結果は、ゴルジ分画に混入するライソゾーム膜が非常に高い抗原性を示し、ゴルジ装置に対する特異抗体の検出を困難にしたと考えられる。この問題は、ゴルジ分画の膜タンパク質から、レクチンカラムを用いてシアロ糖タンパク質を除いたものを抗原として用いることで解決されるであろう。
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