ホヤ胚細胞初期神経分化過程のギャップ結合-GFP融合蛋白発現による解析

1997 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08670066
• 研究機関: 明治薬科大学
• 研究代表者: 高橋 國太郎 明治薬科大学, 薬学部, 教授 (10010034)
• 研究分担者: 田中 資子 明治薬科大学, 薬学部, 講師 (80277730)
• キーワード: ホヤ初期胚 / Connexin mRNA / GFP / コネキシン-EGFP融合蛋白 / EGFP蛍光 / cCCD / GJの消失遅延 / Naスパイク出現遅延

研究概要

胚の発生・分化には数々の細胞間相互作用が必要であり、初期胚細胞間に存在し分子量1.7kD以下の物質を透過させるギャップ結合はそうした相互作用を担う一形式であると考えられている。しかし、いまだ明確な証明は得られていない。本研究計画では、(1)ホヤ初期胚より分離した二細胞誘導系の各発生段階で、すでに報告したように蛍光色素を用いて二細胞間のギャップ結合の変動を定量する。(2)Connexin mRNAを注入して、対照標本のギャップ結合消失時期以後に強制的に発現する。このときConnexin遺伝子にGFP(green fluorescence protein)遺伝子を接続してmRNAを作製し、蛍光測光でconnexinの細胞間接着域への出現を定量する。ことを目的として研究をおこなった。外来性GJをホヤ胚細胞で可視的に発現させるために、ラットConnexin 32-EGFP融合蛋白cDNAを調製、そのcRNAをin vitroで作成した。アカボヤ受精胚は9°C海水中で培養し、8細胞胚期に卵膜を取り除き予定神経および脊索割球とからなる2細胞系を作製し、サイトカラシンBで分割阻止処理後その予定神経割球にConnexin 32-EGFP融合蛋白cRNAを顕微鏡下で注入した。注入後出現したEGFP蛍光をcCCDで計測して融合蛋白の生成を確認した。一方神経誘導後、内因性GJが消失したと考えられる発生30時間以降の同細胞系予定神経割球にLYを注入し、その色素透過性から外来性GJ蛋白の機能の発現を確認した。発生後20〜25時間の神経胚期にこのEGFP融合蛋白のGJを強制発現させると、GJの消失が遅延しそれに対応してNaスパイク出現時期も遅延した。このことから対照2細胞系では内因性GJの消失が予定神経割球の神経形質発現時期を制御しているものと考えられる。

研究成果

• [文献書誌] Okada, T.,Hirano, H.,TAKAHASHI, K.& Okamura, Y: "Distinct neuronal lineages of the ascidian embryo revealed by expression of a sodium channel gene." Developmental Biology. 190. 257-272 (1997)
• [文献書誌] TAKAHASHI, K.& Okamura, Y.: "Ion cxhannels and early development of neural cells." Physiological Review. 78(In press). (1998)
• [文献書誌] Tanaka, M.& TAKAHASHI, K.: "Attempt to monitor expression of exogenous gap junctional proteins in cleavage-arrested ascidian blastomeres by using green fluorescent protein." Japanese Journal of Physiology. 47:Sppl2. S119 (1997)
• [文献書誌] 田中資子、高橋國太郎: "発生と疾患におけるギャップ結合チャネル" 神経研究の進歩. 42(2). 348-357 (1998)