熱産生蛋白サーモジェニンの卵細胞膜への発現を用いた電気生理的,電子顕微鏡的研究

1998 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08670092
• 研究機関: 兵庫医科大学
• 研究代表者: 佐々木 貞雄 兵庫医科大学, 医学部, 助教授 (20104276)
• 研究分担者: 堀 和子 兵庫医科大学, 医学部, 講師 (30068514) ; 中垣 育子 兵庫医科大学, 医学部, 講師 (90084904) ; 辻田 純三 兵庫医科大学, 医学部, 講師 (30104235) ; 堀 清記 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (80068452)
• キーワード: 褐色脂肪細胞 / 寒冷曝露 / 細胞内イオン濃度 / サーモヂェニン / 熱産生 / 脂肪代謝

研究概要

ラットを寒冷および温暖馴化し、その代謝機能を測定した後、褐色脂肪組織を採取した。またアフリカツメガエル(Xenopus)を飼育し、受精卵を採取した。次に採取した褐色脂肪組織より核酸分画を調製し全リボ核酸分画よりミトコンドリアの非共役、熱産生蛋白サーモジェニンの相補的遺伝子の転写産物を精製した。またサーモジェニン遺伝子の転写産物のXenopus Oocyteへの注入を行い、共焦点レーザー顕微鏡で観察しつつパッチおよびホールセルクランプ法を適用し、Ca^<2+>感受性色素(fluo-3)でCa^<2+>濃度を、H^+勾配提示色素(アクリダイオレンジ)でH^+勾配を測定しつつK^+やCl^-電流を測定し、熱産生亢進時の非共役熱産生蛋白をめぐるイオン動態を明らかにする実験を進めた。さらにサーモジェニン遺伝子転写産物を注入発現させたXenopus Oocyteを凍結しその凍結切片を電子プローブX線微小部分析法に供し、非共役発熱蛋白の活動時の細胞膜および内膜系を介してのイオン、元素動態を明らかにした。同時にそのOocyteにサーモジェニンの標識(酵素および蛍光)抗体を注入し、一部のOocyteは免疫電顕用の固定包埋を行い、他の一部はそのまま共焦点レーザー顕微鏡で観察し、サーモジェニン発現の正確な位置関係を明らかにした。以上の研究を押し進めると共に、パッチおよびホールセルクランプ法、X線微小部分析法のデータの検討を行い、卵細胞膜および内膜系に発現した熱産生機構の本態を明らかにした。以上の研究成果を国内学会および国際学会で発表し、論文として国内外の専門誌に発表した。

研究成果

• [文献書誌] Nakagaki,I.,Hori,S.,Sasaki,S.,et.al.: "Changes of the intracellular ion environment in cold acclimated brown adipocyte." (in preparation).
• [文献書誌] Sasaki,S.,Nakagaki,I.,Hori,S.,et al.: "Electrophysiological and electron microprobe studies of ion transport in cold acclimated brown adipocyte." (in preparation).
• [文献書誌] Nakagaki,I.,Tsai,Y.,Sasaki,S.,Yahata,T.,Kanoh,N.,Hori,S.et al.: "Ion mobilization of brown adipose tissue cell induced by cold acclimation" Jpn.J.Biometeor.35(3). S44, (1999)
• [文献書誌] Sasaki,S.,Nakagaki,I.,Tsujita,J.,Kaya,M.,Takemura,et al.: "The intracellular ion environment in cold acclimated brown adipocyte." Jpn.J.Physiol.,. (in press). (1998)
• [文献書誌] Nakagaki,I.,Sasaki,S.,Hori,S.,Yahaka.T.,Kuroshiro,A.: "Changes in intracellular electrolyte levels of brown adipocytes of cold acclimated rat." Third Congress of the Asian-Pacific Organization for cell Biology.Cell Struct.Funct.23 Suppl.,. 165, (1998)
• [文献書誌] Sasaki,S.,Nakagaki,I.,Hori,S.,Yahata,T.,Kuroshima,A.et al.: "The effect of cold acclimation for ion environment of brown adipose tissue cells." Jpn.J.Biometeor.34(3). S35, (1997)