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前年度は、活性酸素を発生するP450分子種の同定とシスプラチン投与や虚血・再循環などの腎障害モデルによるこれらP450分子種の変化を明らかにした。本年度は、この実績をふまえてP450から発生する活性酸素が、実際に生体にどのような変化をもたらすのかを検討した。まず、前年度の検討で肝臓においてフェノバルビタール(PB)で誘導されるCYP2B1というP450が最も高いヒドロキシルラジカル生成活性を示したので、モデルとしてラットにPBを投与して、肝臓の細胞障害について検討した。PB投与によって、肝臓の過酸化脂質量は約2倍に増加した。さらに、肝細胞からDNAを単離して、DNA障害マーカーである8-ヒドロキシ-2'-デオキシグアノシン(8-OHdG)の量を定量したところ、PB投与によって約3倍の上昇が見られた。さらに、CYP2B1と8-OHdGそれぞれの抗体を用いて免疫染色をしたところ、CYP2B1発現部位と8-OHdG発生部位によい一致が見られた。これらの結果からP450によって発生した活性酸素が脂質障害や遺伝子障害を引き起こすことが明らかとなった。続いて、虚血・再循環モデルによる細胞障害について検討した。腎臓由来の細胞であるLLC-PK1細胞を用い培養プレートを密閉した袋に入れることで虚血・再循環モデルを作成した。この系において、NADPHからP450への電子伝達阻害剤を添加すると、細胞障害マーカーである乳酸脱水素酵素の細胞からの放出が阻害された。一方で、P450と電子伝達系を培養細胞に添加して、細胞障害を検討したが、外から加えたP450は細胞障害を起こさなかった。今後は、遺伝子導入などによって細胞の中にP450を導入し、細胞障害が起こるかどうかの検討し、腎障害とP450の発現の関係について検討したと考えている。
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