細菌内毒素による細胞活性化の機作の解明.特に血清成分に依存しない経路について

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08670315
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 自治医科大学
• 研究代表者: 切替 照雄 自治医科大学, 医学部, 講師 (50192563)
• キーワード: 内毒素 / LPS / CD14 / ST2細胞 / IL-6

研究概要

本研究では、LPS受容体およびその直接下流のシグナル伝達機構の特性を明らかにし最終的にそれらの分子を同定する。このためにCD14の発現が全くない骨髄ストローマ細胞株(ST2細胞)を使用する。この細胞を用い、1)LPSアゴニストやアンタゴニストに対する反応性の解析、2)細胞膜上のLPS結合タンパク質の同定およびそれに対する抗体の作製とその生物学・生化学的解析、3)細胞膜画分中のチロシンリン酸化タンパク質の同定、LPS結合タンパク質との異同に関する免疫化学的解析をすることによって、細胞活性化に関与するLPS受容体とその近傍のシグナル伝達分子を明らかにする。
平成8年度は、おもに細胞モデルの確立とLPS結合タンパク質の同定を行なった。
1)CD14陰性骨髄ストローマ細胞株(ST2)の完全無血清培地への馴化およびそのLPS反応性に関する解析。
CD14および血清成分の影響を完全に除外し、CD14や血清に全く依存しない経路だけでLPSに反応できるような細胞モデルを確立する。申請者のこれまでの解析から、マウス骨髄ストローマST2細胞はCD14mRNAの発現はなく、LPSに反応してIL-6やIL-1を産生すること、通常の血清存在下での継代ではST2細胞はマクロファージ細胞株とほぼ同程度のLPS反応性を有していることが分かっている。そこでこの細胞を完全無血清培養液へ馴化させた。さらに種々の構造のLPS、LPSアゴニストやアンタゴニストを用いて、このような血清の影響を完全に除外した系でのLP反応性をマクロファージ細胞株と比較検討した。
2)無血清培養液馴化ST2細胞上のLPS結合タンパク質の同定。
無血清培養液に馴化したST2細胞膜上のLPS結合タンパク質をアイソトープ標識LPSを用いて同定する。具体的には、リガンドブロット法でLPS結合タンパク質を検出する方法と、クロスリンカーを用いて細胞上のLPS結合タンパク質を直接検出する方法との2方法を用いた。その結果、いくつかのタンパク質が同定された。
3)LPS結合タンパク質をふくむ無血清培養液馴化ST2細胞膜画分に対するポリクロナール抗体の作製およびその生物学的解析。
ST2細胞から精製した細胞膜およびこの細胞膜より部分精製したLPS結合タンパク質を抗原としてポリクロナール抗体を作製する。ST2細胞のLPS反応性に及ぼすこれらの抗体の効果、さらにはマクロファージのLPS反応性に及ぼすこれらの抗体の効果を検討し、生物活性と関連のある抗原分画の精製法を検討中である。

研究成果

• [文献書誌] Kirikae,T.,et al: "Microtubule-disrupting agents inhibitnitric oxide producation・・・・・・・・." Infection & Immunity. 64. 3379-3384 (1996)
• [文献書誌] Nakano,M & Kirikae,T: "Biological characterization of Pseudomonas aeruginasa endotoxinreleased by antibiotic treatment ・・・・・・・・." Journal of Endotoxin Research. 3. 195-200 (1996)
• [文献書誌] Kirikae,T.,et al.: "Structural requirements of taxoids for nitric oxide and tumor necrosis factor production ・・・・・・." BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL Res.Comm.227. 227-238 (1996)
• [文献書誌] Kirikae,T.,et al.: "Rhodobacter Sphaeroides diphosphoryl lipid A ・・・・・・・." Journal of Endototoxin Research. 4. in press (1997)
• [文献書誌] Nakano,M Kirikae,T et al: "Artibiotic-induced release of endotoxin ・・・・・・・." Infection. (in press). (1997)
• [文献書誌] 切替照雄.中野昌康: "Surgical Frontier" 生体防御とNO, (1996)
• [文献書誌] Kirikae,T.,et al.: "Endotoxin and Sepsis : molecular mechanisms ・・・・・・・・・・." Therole of scavererger receptors in LPS-induced ・・・・・・・・., (1997)