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我々は日本脳炎ウイルスの構造タンパク質であるprM、Eを細胞内で発現させると、prM、Eからなるエンベロープ粒子を形成し、細胞外へ放出されることを報告してきた。今年度はこのエンベロープ粒子に外来遺伝子を組み込んだ人工ウイルス粒子の形成をめざして、以下の実験を行った。
バクテリアファージT7プロモーターの下流に日本脳炎ウイルスの5'NC(5'末端非構造領域)、構造タンパク質のC、prM、E、レポーター遺伝子としてGFP(発光クラゲ由来のgreen fluorescence protein)、さらに日本脳炎ウイルスの非構造タンパク質NS5、3'NC(3'末端非構造領域)をつないだキメラのDNAを構築し、T7RNA polymeraseを用いて in vitroでRNAを合成した。このRNAをCOS7細胞にlipofectin法で導入し、さらにヘルパーウイルスとして日本脳炎ウイルスを感染させたところ、細胞内でGFPの発現がみられた。ヘルパーウイルスを感染させない場合はGFPの発現はほとんどみられなかった。このことはヘルパーウイルスの感染によって供給されたウイルス由来のRNA複製に関与するNS3、NS5によってキメラRNAが複製されGFPの発現が観察されたことを意味する。さらに細胞の上清を回収し細胞の残さを除いた後、抗日本脳炎ウイルス抗体で免疫沈降し、RNAを抽出後RT-PCRを行ったところ、ヘルパーウイルスを感染させた場合めみ、GFPの遺伝子RNAゆく検出された。このことは日本脳炎ウイルスのエンベロープを持ち、日本脳炎ウイルスとGFPとのキメラのRNA遺伝子を内部に持つ人工ウイルスが形成されたことを示唆している。
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