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我々は、日和見感染症として重要な疾患のひとつである侵襲性肺アスペルギルス症において、迅速で非侵襲的な診断法である血清を用いたnested PCR法を開発した。
1、nested PCR法
1)プライマー:Aspergillus fumigatusの18s ribosomal RNAのV7からV9領域における遺伝子配列において、アスペルギルス属に特異的な領域からnested PCRが可能な2組を設定した。
2)PCR条件:1st PCRでは、denature-94℃1分、annealing-50℃1分、extension-72℃3分を30cycle、さらに2nd PCRでは、annealingを65℃に変えて30cycleとした。
3)特異性:Candida属、Cryptococcus属、Trichosporon属およびPenicillium属を含む真菌14菌種、さらに一般細菌10菌種において本法は、Aspergillus属5菌種においてのみ陽性となった。
4)検出感度:A.fumigatus精製DNA量1pgまで検出可能であった。
2、血清からのDNA抽出法
Proteinase K処理のみを用いた酵素法によって血清からAspergillus属DNAを抽出した。
3、マウス侵襲性肺アスペルギルス症実験モデルにおける各種診断法との比較検討
マウスを用いた実験モデルでは、感染24時間後より本法は陽性となり、陽性率は71%であった。この結果に対して、Galactomannan抗原検出法の陽性率は43%、血液培養はすべて陰性であった。
4、患者血清における検討
病理組織学的に侵襲性肺アスペルギルス症と診断された20症例における保存血清を用いて本法の有用性を検討した。その結果は、本法の陽性率70%、Galactomannan抗原検出法陽性率60%、血液培養はすべて陽性であった。
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