| 研究概要 |
研究目的:モルモット単離心室筋細胞を用いて、ATP感受性Kチャネル(K_<ATP>チャネル)の開口あるいは閉鎖の細胞内Ca^<2+>([Ca^<2+>]i)動態に及ぼす影響の機序を明かにすることを目的とする。
方法:1.単離心筋細胞の作成。雄性モルモットの摘出心をLangendorff法、Krebs Henseleit bicarbonate bufferにて灌流し、低Ca^<2+>溶液、プロテアーゼ、コラゲナーゼ等を用いて順次灌流後、左心室筋を細切、酵素溶液にてincubate、濾過法にて心筋細胞浮遊液を作成する。2.細胞内イオンの測定。単離されたモルモット心室筋細胞の[Ca^<2+>]i,[pH]iの測定には蛍光指示薬Fura-2,BCECFを細胞に負荷後、2波長UV励起光(Ca^<2+>:340nm/380nm,pH:450nm/500nm)による蛍光強度比(Ca^<2+>:500nm,pH:540nm)を光電子増倍管にて測定した。3.心筋細胞の灌流にはHEPES-buffered Tyrode溶液を用いた。心筋に微小ガラス電極を刺入しSwitch clmap法により、活動電位、Ca^<2+>電流を測定した。微小電極を介したCurrent clampにて細胞を刺激、収縮性はedge detection systemを用いて測定した。4.グルコース無添加のTyrode液に1mM Na_2S_2O_4を加えて化学的無酸素を3分間誘発し、再酸素化を行った。
結果・結論:1.無酸素により、収縮振幅の減少に伴いCa^<2+> transientの振幅減少と、拡張期[Ca^<2+>]i上昇、細胞内pHの低下を観察した。さらに無酸素では活動電位の短縮を認めた。再酸素化によりいずれも無酸素前の好気的条件下の値に復した。2.好気的条件下にてK_<ATP>チャネル開口薬lemakalimは濃度依存性に活動電位を短縮させたが、無酸素条件下では活動電位をさらに著明に短縮した。しかしlemakalimは無酸素における拡張期[Ca^<2+>]i上昇に対して抑制傾向を示すにとどまった。無酸素による活動電位の短縮にはATP感受性ATP感受性Kチャネルの役割が重要であり、その活性化は細胞内Ca overloadの軽減に関与することが示唆された。
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