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Prothrombinは、VitamineKの存在下に肝臓で合成される一本鎖糖蛋白質で、種々の生理的条件下で活性化されてthrombinとなり、血液凝固を中心に種々の生理機能を果たしている。当教室において外来経過観察している先天性prothrombin欠乏症(異常症)一家系につき遺伝子異常の解析を行ってきた。
昨年より患者より抽出した患者genomicDNAより、PCR-SSCP法を用いて13個のexon及びExon-intron boaderを13 pairのprimerを用いてscreeningしたが、異常を示唆するShift bandを認めなかった。このため、SSCPの条件を見直し、すべてのPCR領域が250bp前後になるように新たに20 pairのprimerを準備し同様の手法にてscreeningを行ったが、やはり異常を示唆するShift bandを認めなかった。以上のことより、screening法に問題があるのか、あるいはprothronbinの発現を制御しているpromoter領域に異常があるのか、この問題をclearするために新たな実験を計画し、現在まで行ってきた。一つは、患者genomicDNAより、PCR-Direct Sequenceによりprothrombinのcoding領域とpromoter領域をfull-sequenceすることである。7個のexonまで解析が終了しているが異常を見いだしていない。もう一つは、promoter領域の解析である。正常人のprothronbinのpromoter(-1423〜+115)領域をPCRで増幅し、pGL3-Luciferase-vectorにcloningしたところである。今後、ヒト肝細胞由来HepG2細胞にtransfectionしpromoter活性を測定しうる実験系を構築し、患者由来のpromoterと比較検討し、患者の遺伝子解析を終了したい。
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