| 研究概要 |
本研究では、以下の1〜4を行った。
1.ヒトインスリン遺伝子プロモーターのグルコース反応領域の解析
CAT assayにより、ヒトインスリン遺伝子のグルコース反応領域が転写開始部位より上流のA3 element(TAAT配列)を含む-230から-200bpの約30bpに存在することを決定した。
2.グルコース反応領域に結合する転写因子の解析
・-230から-200bpの合成oligo(プローブ)と、この領域内のTAATをTCCTに変異させたプローブを用いたEMSAにより、TAAT配列のA3 elementに結合したC1とC2のバンドを認めた。さらに、UV crosslink assayを行い、このC1,C2のバンドを形成する転写因子の分子量は、約36、48kDaであることが判明した。
・A elementのTAAT配列に結合する転写因子のinsulin promoter factor1(IPF1)の抗体を合成ペプチド用いて作成し、同抗体を用いたEMSAにて、C2のバンドを形成する転写因子はIPF1,C1のバンドを形成する転写因子はdegradated IPF1又はIPF1の類似蛋白であることが示唆された。
3.A3 element(TAAT配列)に結合する転写因子の機能解析
酸フォスファターゼ処理した核蛋白を用いたEMSAにより、C1、C2のバンドが非処理バンドに比べTAAT配列への結合能が減少していることを確認し、転写因子のリン酸化が結合能に関与していることが示唆された。
4.IPF1のリン酸化アミノ酸の同定とprotein kinaseの機能解析
・各抗ホスホタイロシン、ホスホセリン、ホスホスレオニン抗体を用いて、各グルコース濃度培養下の核蛋白とのウエスタンブロットを行った結果、高グルコースではIPF1のスレオニンのリン酸化が有意に増加していた。
・各種のprotein kinaseを用いたin vitro phosphorylation assayにて、このスレオニンのリン酸化を調節しているのは、protein kinase Cの可能性が示唆された。
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