| 研究概要 |
まず、高度転移活性を有するRC-K8細胞のサブクローニングを行い、uPAを最も強く発現しているRC-K8細胞株を得た。次いで、ヒューマンサイエンス研究資源バンクから、ウロキナーゼ(uPA)cDNAを含むplasmid(bluescript)SKUK-8を購入した。そのプラスミドから制限酵素でuPA cDNA切り出し、antisense-orientedにpME発現ベクターに組み込んだ。次いで、このプラスミドを今回購入したGene Pulserを用いて電気的にRC-K8細胞にトランスフェクトした。G418を含むRPMI-1640でセレクションし、uPA産生が抑制されたneo-resistant細胞クローンの樹立を行った。約3ヶ月のG418を含むRPMI-1640で培養した結果、uPAの合成発色基質であるS-2444を用いた方法でもまたfibrin zymography法でも、部分的にuPA産生が抑えられた細胞株が樹立された。現在それらのサブクローン化された細胞株を用い、マトリゲルの培養チャンバーで培養し浸潤能を検討した。残念ながら上記の細胞間で明かな差が得られなかった。得られた細胞クローンでは十分なアンチセンス効果が発揮されていないと判断され、新たに、より強いアンチセンス効果を期待してuPAの蛋白翻訳開始部分から540bpのアンチセンスをpCIベクターに導入し、今回はハイグロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドをコトランスフェクチョンしてセレクショシした。そのアンチセンス遺伝子導入細胞のサブクローニング培養中に、富山医科薬科大学医学部から岡山大学医学部に移籍することになり実験の中断を余儀なくされたが,そのアンチセンスの導入された細胞のサブクローニングを進め,目的の細胞クローンを樹立したが,その細胞の浸潤転移活性の検討などを行ってデータを整理中であるため,研究結果をまとめる段階に至っていない。
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