ヘパラン硫酸プロテオグリカン・Ryudocanの生物学的分子機能解析

1996 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 08671224
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 小嶋 哲人 名古屋大学, 医学部, 助手 (40161913)
• 研究分担者: 都築 忍 名古屋大学, 医学部, 医員 ; 唐渡 雅行 名古屋大学, 医学部, 医員
• キーワード: 血管内皮細胞 / Ryudocan / ヘパラン硫酸プロテオグリカン / bFGF / midkine(MK) / Tissue Factor Pathway Inhibitor(TFPI)

研究概要

既に我々は、抗ヒトRyudocanモノクローナル特異抗体によるアフィニティーカラムを用いたヒトRyudocan(ヘパラン硫酸プロテオグリカン)分子の効率良い精製法を開発している。本年度は、これと従来のイオン交換カラム精製法を組み合わせることにより、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞から大量にヒトRyudocan分子を純化精製した。精製したヒトRyudocan分子のSDS-PAGEでは、Heparitinase処理すると分子量30kDaの単一bandになり、一方、Chondroitinase処理では160kDaのsemear bandのままで、これらの所見から精製ヒトRyudocanがGlycosaminoglycan chainとしてヘパラン硫酸をもつヘパラン硫酸プロテオグリカンであることが確認された。また、ligand-binding assay法を用いた精製ヒトRyudocanに親和性をもつ分子のスクリーニングで、各種細胞外マトリックス蛋白、細胞増殖因子、プロテアーゼインヒビターなどを検索した結果、細胞増殖因子であるbFGF、レチノイン酸に誘導され神経線維伸長作用をもつやはり細胞増殖因子であるmidkine(MK)、さらには外因系血液凝固反応の生理的抑制因子であるTissue Factor Pathway Inhibitor(TFPI)に強い親和性をもつことが判明した。そして、各リガンド分子に対しての精製ヒトRyudocanの結合は濃度依存性でかつ飽和曲線を描くことが判明し、その結果からそれぞれScatchard Plotを用いてみかけ上の解離定数(Kd)を求めると、bFGFには0.5nM、MKには0.3nM、TFPIには0.74nMであり、MKに最も強い親和性を示すことが判明した。

研究成果

• [文献書誌] T.Kojima,A.Katsumi,et al.: "Human Ryudocan from endothelium-like Cells Binds Basic Fibroblast Growth Factor,Midkine,and Tissue Factor Pathway Inhibitor." J.Biol.Chem.271(10). 5914-5920 (1996)
• [文献書誌] A.Takagi,T.Kojima,et al.: "Structural Organization and Promoter Activity of the Human Ryudocan Gene." J.Biochem.(Tokyo). 119(5). 979-984 (1996)
• [文献書誌] T.Yamazaki,T.Kojima,et al.: "Analysis for anthrombin gene polymorphisms in Japanese subjects and cosegregation studies in families with hereditary antithrombin deficiency." Thromb.Res.82(3). 275-280 (1996)
• [文献書誌] A.Katsumi,T.Kojima,et al.: "Protein C Nagoya,an Elongated Mutant of Protein C,Is Retained Within the Endoplasmic Reticulum and Is Associated With GRP78 and GRP94." Blood. 87(10). 4164-4175 (1996)
• [文献書誌] T.Yamazaki,T.Kojima,et al.: "Molecular Basis of a Hereditary Type I Protein S Deficiency Caused By a Substitution of Cys for Arg474." Blood. 87(11). 4643-4650 (1996)
• [文献書誌] Y.Okamoto,T.Kojima,et al.: "A Novel Nonsense Mutation Associated with an Exon Skipping in a Patient with Protein S Deficiency Type I" Thromb.Haemost.75(6). 877-882 (1996)