| 研究概要 |
我々が継体培養している10種類の樹立ヒト悪性グリオーマ細胞からDNAを抽出し、Southern blot analysisによりRBあるいはp16のdeletionもしくはmutationを検索したところ、U-87MG,U-251MG,U-373MGでp16のdeletionがみられ、U-373MGではRBのdeletionもみられた。さらにsequenceの確認も行った。そして、RBとp16遺伝子の発現ベクターを作製するために、RBとp16遺伝子のcDNAクローニングを行い、mammalian expression vectorに挿入した。そして、グリオーマに特異的に強く結合するASHG4モノクローナル抗体にリポソームを結合させ、さらにそのリポソームに作製したRB遺伝子とp16遺伝子を含む2種類の発現プラスミドをそれぞれ封入させた。このようにして作製したポソーム-モノクローナル抗体-DNA複合体を用いて、in vitroの実験を行った。
すでに見つけたRBおよびp16癌抑制遺伝子を欠失するU-373細胞にこのモノクローナル抗体結合リポソームに封入されたRB発現プラスミドを同時にtransfectionし、transfectantをG418でselectionして、トリパンブルー染色によるcell count法によりその増殖能を対照群と比較した。なおこの時の対照群としては、Neo R遺伝子発現プラスミドをtransfectionした細胞を同様にG418でselectionしたものを用いた。結果は、対照群に比較して増殖能の抑制がみられたが、統計学的に有意差がでるほどには抑制されず、現在実験をくり返して施行しているところである。従って、そのプラスミドの発現し続ける期間の測定をするまでには今年度は至らなかった。
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