| 研究概要 |
(1)I型トランスグルタミナーゼの組み替え蛋白質によるrecombinantポリクローナル抗体の作成
特異プライマーを作成、ラットcDNAに対してPCR増幅した産物をpGEX plasmidにligateした。次いでpGEX plasmid/GST fusion protein系を用いて大腸菌BL2内にこのplasmidをtransfectし、組み替え蛋白質を作成・精製、白色家兎に感作、ポリクローナル抗体を作成した。
(2)正常ヒトおよびラットの角結膜組織でのmRNA,蛋白質の発現
正常ヒトおよびラットの角結膜組織、SV40不死化培養角膜上皮細胞でのI型トランスグルタミナーゼmRNAの発現を特異プライマーを用いたRT-PCR法にて検討した。ヒト角結膜、ラット角結膜、ウイルス不死化細胞いずれからも目標の約500bpの位置にバンドが得られ、制限酵素切断パターンにてI型トランスグルタミナーゼDNAと確認された。またヒトおよびラット結膜から得られたサンプルのDNAシークエンシングを行ったところ、84%のmatchingが得られた。正常ヒトおよびラットの角結膜組織から得た蛋白質に対し、作成ポリクローナル抗体を一次抗体、抗ラビットヤギ抗体を二次抗体としたWestern-blottingを行い、90kDaの位置にバンドを検出、ヒト・ラットのI型トランスグルタミナーゼには交叉性のあることが示唆された。
(3)眼表面組織でのI型トランスグルタミナーゼの局在
作成した抗体により、I型トランスグルタミナーゼの局在を免疫組織化学的手法により検討した。ヒト角膜上皮では、細胞膜部分に一致した発現が全層にわたって認められたのに対し、ヒト結膜組織では基底膜に近い部分に強い染色性が観察された。ラット角結膜組織でもヒト組織と同様に、角膜組織では上皮全層の細胞膜部分に一致した発現を、結膜組織では基底層付近に強い上皮全層の細胞膜部分に一致した発現を認められた。従来行われてきたI型トランスグルタミナーゼ基質のcornifin染色所見との間には、差異があった。
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