| 研究課題/領域番号 |
08672048
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| 研究機関 | 産業医科大学 |
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研究代表者 |
高橋 広 産業医科大学, 医学部, 助教授 (00129511)
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| 研究分担者 |
周 正喜 産業医科大学, 医学部, 助手 (60269066)
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| キーワード | 神経栄養因子 / 網膜 / 培養 / PCR法 / SV40 large T遺伝子 / トランスフェクション / 株化細胞 |
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| 研究概要 |
成熟した哺乳動物の中枢神経細胞の生存・再生は困難とされていたが、我々は従来よりミュラー細胞が網膜神経細胞の生存・再生に寄与していることを明らかにし、ミュラー細胞が神経栄養因子を産生していることを示唆した。本研究にて、ミュラー細胞が網膜神経細胞の生存ならびに再生に必要な神経栄養因子であるnerve growth factor(NGF)、brain-derived neurotrophic factor(BDNF)、glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF)、interleukin-6(IL-6)遺伝子の発現をmRNAレベルで確認できたことを平成8年に報告した。本年度は神経網膜を単層培養して得られたCondition Medium(CM)の効果をin vitroおよびin vivoにて検討した。CMを濃縮・添加したDefined Mediumにて網膜芽細胞腫培養細胞(Y79細胞)を培養したところ神経突起らしきものが伸展してきたが、網膜神経細胞の培養ではその効果は定かではなかった。in vivoの実験系、すなわち光傷害眼やRCSラット眼の硝子体内にCMを注入し、網膜神経細胞、特に網膜視細胞の生存を検討したが、明白な効果は認められなかった。
そこで、大量の神経栄養因子を得る必要があると考え、株化細胞の樹立を試みた。ミュラー細胞にSV40 large T遺伝子をもつプラスミドをエレクトロポレーション法にてトランスフェクションし株化細胞を樹立した。この細胞をconfluentに培養した後acid guanidium thiocyanate-phenol chloroform法にてRNAを抽出し、reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)法を用い、神経栄養因子の遺伝子レベルの発現を検討し、NGF、BDNF、GDNF遺伝子の発現をmRNAレベルで同様に確認した。現在、CMから神経栄養因子の抽出を行っているが、未だ十分に得ることはできていない。
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