| 研究課題/領域番号 |
08672053
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
尾花 和子 東京大学, 医学部・附属病院, 助手 (60272580)
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| 研究分担者 |
土田 嘉昭 群馬県立小児医療センター, 院長 (80010164)
上井 義之 東京大学, 医学部・附属病院, 助手 (70177567)
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| キーワード | N-Myc蛋白 / ペプチド抗体 / anti-17M / rN-Myc |
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| 研究概要 |
抗N-Myc蛋白ペプチド抗体を生成した。N-Myc蛋白の既知のアミノ酸配列の中から二種のペプチドHGRGPPTAGSTAQSPG(codon.136-151)及びGVARPRPGGRQTSGGDH(codon.223-239)を選び、これを合成し、lisine coreにmultiple antigen peptide(MAP)methodにより結合させ、抗原として家兎に免疫した。得られた家兎血清のlgG分画をアフィニティ・カラムにかけて精製した。精製されたlgGの特異性をウエスタンブロットにて検定したところこ、抗GVARPRPGGRQTSGGDH特異lgGは、N-mycがん遺伝子発現がしられているヒト神経芽細胞腫の細胞株SK-N-BE、NGP、SK-N-DZ、NMBについてN-Myc蛋白と思われるバンドの発現が強くみられたが、他のヒト横紋筋肉腫細胞株やヒトユ-イング肉腫細胞株では反応を示さなかった。また、得られた二種の特異lgGを用いて免疫染色を行ったところ、抗GVARPRPGGRQTSGGDH特異lgGによりN-mycがん遺伝子発現がしられているヒト神経芽細胞腫の細胞株TNB-9、CHP-134、SK-N-BE、NGP、SK-N-DZ、NMBの核内に強い染色がみられたが、抗HGRGPPTAGSTAQSPG特異lgGでは発色はみられなかった。以上より、抗GVARPRPGGRQTSGGDH特異lgG(anti-17M)は抗N-Myc蛋白ポリクローナル抗体であると考えられる。
さらに、N-mycがん遺伝子のexon2、exon3の一定の長さをクローン化し、発現ベクターpET16bに挿入することによりrecombinant N-Myc蛋白を得た。このrN-MycをNi2^+アフィニティ・カラムにかけて精製し、得られた精製rN-Mycを用いてimmunoblotを行ったところ、抗GVARPRPGGRQTSGGDH特異lgG(anti-17M)と反応した。
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