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生後1週のマウス頭蓋冠を切り出し、頭頂骨を組織培養に供した。両側頭頂骨頂にピン穴をあけ、クリップを挿入して、両外側に7gの持続的牽引力をかけ、2週間培養した。これらの操作により、正中縫合は開大、伸展して線維化が進み、約2週間で石灰化が開始した。本年度は、負荷が加わってから石灰化が開始する2週までの早期反応に着目して、骨基質タンパクの産生を、経時的に、RT-PCR法にて検索した。試料は維持的に縫合部を切り出しmRNAを抽出した後、randum primerを用いて逆転写を行い、目的とするプローブでPCRを行った。使用したプローブは、Osteonectin(ON)、Osteopontin(OPN)、Osteocalcin(OC)およびBone Morphogenetic Protein 4(BMP4)である。これらの結果、OPNは負荷後2、3日で急速に発現をみて、2週近くでは検出されなくなった。ONは、負荷以前より発現をみていたが経時的に増加の傾向を示した。OCはON同様、負荷以前より発現をみていたが、時間とともに検出されなくなった。BMP4は、負荷直後と石灰化開始期に信号を認めた。これらの結果より、組織において、石灰化の開始以前に種々の骨基質タンパクの転写が、それぞれ独自の時間コースをとって行われていることがうかがえる。これらの骨基質タンパクの時間的、空間的分布(組織化学、in situ hybridization)を比較検証することにより、その役割がさらに明確になるものと考える。現在、RT-PCRの結果をもとに、in situ hybridizationによる組織検索を行っている。
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