| 研究課題/領域番号 |
08672484
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
藤間 貞彦 北海道医療大学, 薬学部, 教授 (30001043)
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| 研究分担者 |
木村 昭彦 久留米大学, 医学部, 助手 (00211201)
吉村 昭毅 北海道医療大学, 薬学部, 講師 (60220737)
村井 毅 北海道医療大学, 薬学部, 助手 (50260823)
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| キーワード | 胎児-新生児 / 先天代謝異常 / 胆汁酸生合成 / オキソ不飽和胆汁酸 / 酵素免疫学的測定法 / ガスクロマトグラフィー質量分析 / 高速液体クロマトグラフィー / 3-オキソ-Δ^4-ステロイド5β-還元酵素 |
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| 研究概要 |
最近、新生児期に高チロジン血症I型類似の胆汁うっ滞から肝硬変に至り、乳児期に肝不全で死亡した症例が各地で多発している。申請者らは、本症患者の尿中から3-オキソ不飽和胆汁酸が多量に存在することを見出した。本胆汁酸は胆汁酸生合成の中間体であり、上記疾患は5β-還元酵素の欠損による先天代謝異常と推論されたので、本研究は、胆汁酸の標品を化学合成してGC-MSにより同定したのち、適確な微量分析法を開発し、抱合型式と共に胆汁酸の体内動態の解明と酵素免疫測定法を開発して本疾患の簡便かつ迅速なる病態解析法を確立することを目的とした。
1)オキソ不飽和胆汁酸及び抱合型胆汁酸の合成:オキソ不飽和胆汁酸CA-Δ^4-3-one(I)及びCDCA-Δ^4-3-one(II)の標品をCA、CDCAを原料として化学合成した。これらの7位水酸基は脱離しやすく、シアノリン酸ジエチルを縮合剤として緩和な条件によりグリシン及びタウリンの各抱合体を合成した。
2)GC-MSによる胎児性胆汁酸微量分析法の開発と体内動態の解析:オキソ不飽和胆汁酸の体内動態及び生成機序を明らかにするため、合成標品を用いてGC-MSのSIM法による胆汁酸の高感度定量法を開発したのち、新生児及び患児の尿、血液について胆汁酸組成の変動を検討した。
3)抱合型オキソ不飽和胆汁酸のHPLCによる一斉微量分析法の開発:抱合型標品の3-ケトンをアンスロイル誘導体として蛍光検出HPLCによる分離法を検討し、緩和な前処理法を検討して高精度の一斉微量定量法を開発した。
4)オキソ不飽和胆汁酸の酵素免疫学的測定法の開発:I、IIのβ-アラニン-BSA結合物を調製し、家兎に免疫して抗血清を作成した。抗体の力価及び特異性の評価はトリチウム標識抗原を用いるRIA法により検討した。次いで、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合物を用いる2抗体法によりELISA法を開発し、臨床医療への適用を図った。
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